血液蛋白質(zhì)組的檢測(cè)深度——如何看待不同的策略方案？
根據(jù)WHO疾病分類(lèi)組織(international classification of disease, ICD)的統(tǒng)計(jì)，人類(lèi)疾病的種類(lèi)超過(guò)14500種，血漿/血清作為臨床檢驗(yàn)最重要的樣本，具有無(wú)創(chuàng)易獲得、安全性高、蛋白分子含量豐富等特點(diǎn)，可反映出機(jī)體生理和病理狀態(tài)，在疾病早期診斷、預(yù)后指導(dǎo)等生物標(biāo)志物研究方面具有重要的研究?jī)r(jià)值。血液是人體的體液庫(kù)，血液中的血漿組分（Plasma）中包含了來(lái)自人體各個(gè)組織和器官的信息分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝物等），通過(guò)血液循環(huán)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離的信息傳遞和調(diào)控。血漿信息分子中，蛋白質(zhì)的種類(lèi)（>1萬(wàn)種）和復(fù)雜度（cSNP（單氨基酸改變）、isoform（可變剪接體編碼產(chǎn)物）、PTM（翻譯后修飾））遠(yuǎn)超其它分子類(lèi)型。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是生命體的功能分子和執(zhí)行者，血漿蛋白質(zhì)組（Plasma Proteome）的動(dòng)態(tài)變化直接指針人體生理和病理的變化；此外，血漿組分穩(wěn)定，易于獲取，對(duì)患者的創(chuàng)傷小等諸多優(yōu)點(diǎn)，使得從血漿中篩選與人體生理和病理相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)分子標(biāo)志物（Biomarker）成為長(zhǎng)久以來(lái)的研究熱點(diǎn)。
隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，基于質(zhì)譜的深度血液蛋白質(zhì)組學(xué)正逐漸成為血液蛋白質(zhì)的科研利器，在腫瘤研究，免疫疾病，心血管代謝性疾病，生殖領(lǐng)域等均為不可或缺的研究工具。但血液樣本的特殊性為蛋白組學(xué)的分析帶來(lái)了巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)。
01. 血液樣本特殊在哪？
為什么說(shuō)血液樣本在蛋白組學(xué)研究中具有巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)及取得的成果非常局限？這主要是由血液樣本的特殊性決定，那接下來(lái)我們就一起看看血液樣本到底特殊在哪？
構(gòu)成血液蛋白組的蛋白質(zhì)可分為三類(lèi)：
1）第一類(lèi)：在血液中具有功能的蛋白質(zhì)，包括血清白蛋白（HSA），大約占總蛋白的50%；載脂蛋白，在脂質(zhì)運(yùn)輸和內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用；先天免疫反應(yīng)的急性期蛋白及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的蛋白。
2）第二類(lèi)：在循環(huán)中的組織滲漏蛋白，如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASAT）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALAT）等，用于肝臟疾病的診斷。
3）第三類(lèi)：信號(hào)分子，如小蛋白激素（胰島素）及細(xì)胞因子，這類(lèi)蛋白在穩(wěn)態(tài)下通常有很低的豐度。比如：IL-6的基線(xiàn)水平為5 pg/mL，而較為豐富的白蛋白（HSA）約為50 mg/mL。
由此可見(jiàn)，與HSA相比，信號(hào)分子蛋白含量相差極大，血液蛋白含量跨越極大，可達(dá)1010，而含量極低的蛋白才是疾病的特異性生物標(biāo)志物或者藥物作用的靶標(biāo)。
血液樣本的特殊性在哪？血液中蛋白質(zhì)的含量跨越極大，高豐度的白蛋白等掩蓋了真正需要研究的低豐度蛋白，如IL-6等信號(hào)分子。信號(hào)分子等低豐度蛋白的價(jià)值及光芒急需被挖掘，被看見(jiàn)。那怎么才能被看見(jiàn)呢？
圖1.血液蛋白構(gòu)成及濃度范圍
02. 低豐度蛋白：怎么能被看見(jiàn)？
由于血液蛋白質(zhì)的特殊性，較寬的動(dòng)態(tài)范圍限制了質(zhì)譜技術(shù)在血液中發(fā)現(xiàn)新的疾病標(biāo)志物。
為了突破這一瓶頸，主要有2種應(yīng)對(duì)策略：
1）第一種：高豐度蛋白去除技術(shù)是一種常見(jiàn)的血漿樣品前處理方法，通過(guò)去除白蛋白、球蛋白、免疫球蛋白等高豐度蛋白，有效提高樣品中低豐度蛋白的濃度。目前，高豐度蛋白去除的主要方法有超濾法、電泳法、抗體親和法等。
超濾法：以蛋白質(zhì)的大小和結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，在驅(qū)動(dòng)力（通常由離心或壓力條件產(chǎn)生）下將大分子高豐度蛋白分離出來(lái)，起到去除目的。該方法簡(jiǎn)單直接，成本低廉，沒(méi)有物種限制，但對(duì)蛋白沒(méi)有特異性，導(dǎo)致低豐度蛋白丟失嚴(yán)重，目前超濾法正在逐漸被淘汰。
電泳法：通過(guò)電泳將血漿蛋白分離成不同的條帶，實(shí)現(xiàn)去除高豐度蛋白的目的。蛋白質(zhì)在一維電泳里按照等電點(diǎn)分離，在第二維電泳里按照相對(duì)分子質(zhì)量分離，與超濾法相比，電泳法能夠更精準(zhǔn)地分離目標(biāo)蛋白。但二維凝膠電泳耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，分辨率和靈敏度不高，一次所需上樣量大且操作復(fù)雜。
沉淀法：向血漿樣品中添加可以引起蛋白質(zhì)聚集和沉淀的試劑，如硫酸銨（AS）、二硫蘇糖醇（DTT）等，通過(guò)離心去除沉淀蛋白，質(zhì)譜分析上清液。其主要優(yōu)勢(shì)為操作簡(jiǎn)單，成本低廉，沒(méi)有物種限制。盡管沉淀法操作簡(jiǎn)單且被廣泛使用，但其低特異性和易導(dǎo)致低豐度蛋白丟失限制了它的大范圍應(yīng)用。近年來(lái)，幾種改進(jìn)或優(yōu)化的沉淀方法被提出，包括兩步差分蛋白質(zhì)溶解度方法（使用多種濃度的AS來(lái)分餾和耗盡血漿樣品中的高豐度蛋白）、串聯(lián)去除法（結(jié)合硫酸銨沉淀和蛋白質(zhì)親和層析）等。
基于抗體的免疫親和法：使用單克隆或多克隆抗體特異性去除血漿中的高豐度蛋白，從而純化血漿樣本。抗原與抗體結(jié)合具有良好的特異性和重復(fù)性，可用來(lái)去除那些在超濾法或電泳法中不能去除的高豐度蛋白?？贵w親和法已有很多商品化抗體親和柱，如 Agilent、Millipore、Sigma-Aldrich、Thermo 等公司的抗體親和柱。目前的抗體親和柱已從最初的單抗發(fā)展到能同時(shí)去除 6 種、7 種、12 種、14種或 20 種的多親和抗體柱。串聯(lián)去除策略是去除更多高豐度蛋白的有效方法，如IgY4-SuperMix串聯(lián)法可檢測(cè)和定量血漿中的4,500種蛋白質(zhì)。但基于抗體的免疫親和法具有高成本、樣品上樣能力有限、超載時(shí)柱效下降等缺陷且固定化抗體可能無(wú)法識(shí)別高豐度蛋白的某些亞型。與此同時(shí)，高豐度蛋白的海綿效應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致去除高豐度蛋白的同時(shí)丟失部分低豐度蛋白，從而導(dǎo)致潛在的生物標(biāo)志物丟失。
基于多肽的免疫親和法（六肽配體親和法）：基于飽和-超載色譜原理，采用一個(gè)基于微球的高度多樣化的大型組合肽配體庫(kù)，可即時(shí)稀釋高豐度蛋白和濃縮低豐度蛋白。每個(gè)蛋白與它們的肽結(jié)合伙伴之間具有特異性的相互作用。當(dāng)樣品進(jìn)入試劑盒后，高豐度蛋白與它們所對(duì)應(yīng)的配體迅速飽和，相反，豐度較低的蛋白質(zhì)不會(huì)超載它們各自的配體，從而以濃度依賴(lài)的方式結(jié)合。高豐度蛋白質(zhì)的部分消耗和低豐度的相對(duì)富集導(dǎo)致了整體蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)范圍的壓縮。然而，蛋白質(zhì)和ProteoMiner肽庫(kù)之間親和力不同是該技術(shù)的主要局限之一。如果配體對(duì)特定蛋白質(zhì)沒(méi)有親和性，或者親和性很低，那么蛋白質(zhì)就不會(huì)被捕獲，從而無(wú)法被檢測(cè)到。此外，pH等環(huán)境因素也可能影響其親和力。
血液蛋白組的傳統(tǒng)前處理策略是去除高豐度蛋白。但是有一些不常見(jiàn)的物種由于免疫結(jié)合的特異性無(wú)法適配市售的去高豐度試劑盒且在去除高豐度蛋白的同時(shí)會(huì)帶走很多低豐度蛋白, 而丟失蛋白質(zhì)信息。例如, 去除白蛋白的同時(shí)很可能會(huì)帶走與白蛋白結(jié)合的細(xì)胞因子、肽類(lèi)激素以及脂蛋白等低豐度蛋白。這種前處理方法有著明顯的局限性。低豐度蛋白富集可以有效避免傳統(tǒng)方法的缺陷，增加血漿蛋白組的檢測(cè)深度和定量準(zhǔn)確性。
2）第二種：富集低豐度，通過(guò)篩選不同理化性質(zhì)得到的納米顆粒，其主要原理是經(jīng)特殊修飾的磁球接觸血漿后，表面可吸附大量蛋白質(zhì)形成蛋白冠。根據(jù)“Vroman效應(yīng)”，更強(qiáng)結(jié)合親和力的蛋白會(huì)和早期吸附的蛋白發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性置換，從而對(duì)多種低豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行富集，有效避免蛋白信息丟失。磁性納米材料在低豐度蛋白富集領(lǐng)域備受矚目，采用納米顆粒特異性富集血液樣本中低豐度蛋白，再結(jié)合新一代Orbitrap? Astral? 高分辨質(zhì)譜儀平臺(tái)，讓血液蛋白鑒定深度和通量實(shí)現(xiàn)了質(zhì)的飛躍。PuriMag BioTech依托自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的獨(dú)特納米磁珠制備技術(shù)和表面修飾技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一系列的針對(duì)不同蛋白亞群的低豐度蛋白富集試劑盒（http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/8096211554.html），實(shí)現(xiàn)了血漿和血清樣本的蛋白高深度分析。
以下是血液中22種高豐度蛋白質(zhì)的中英文名稱(chēng)、分子量（kDa）和等電點(diǎn)（pI）。請(qǐng)注意，這些數(shù)值是典型的或平均值，實(shí)際值可能因個(gè)體差異、蛋白質(zhì)修飾和其他因素而有所不同。
1. **白蛋白 (Albumin)** - 分子量: 66-69 kDa, pI: 4.6-4.9
2. **α1-抗胰蛋白酶 (Alpha-1 Antitrypsin, AAT)** - 分子量: 52 kDa, pI: 5.0-5.3
3. **α1-酸性糖蛋白 (Alpha-1 Acid Glycoprotein, AAG or Orosomucoid)** - 分子量: 44 kDa, pI: 3.5-3.8
4. **α2-巨球蛋白 (Alpha-2 Macroglobulin, α2M)** - 分子量: 720-800 kDa, pI: 5.5-6.0
5. **C-反應(yīng)蛋白 (C-Reactive Protein, CRP)** - 分子量: 115 kDa, pI: 5.7-6.1
6. **銅藍(lán)蛋白 (Ceruloplasmin)** - 分子量: 132-150 kDa, pI: 5.5-6.0
7. **纖維蛋白原 (Fibrinogen)** - 分子量: 340 kDa, pI: 5.2-5.4
8. **免疫球蛋白G (Immunoglobulin G, IgG)** - 分子量: 150 kDa, pI: 6.5-7.5
9. **免疫球蛋白A (Immunoglobulin A, IgA)** - 分子量: 160 kDa (單體), pI: 6.5-7.5
10. **免疫球蛋白M (Immunoglobulin M, IgM)** - 分子量: 970 kDa (五聚體), pI: 5.0-7.0
11. **轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Transferrin)** - 分子量: 79.5 kDa, pI: 5.5-6.2
12. **α1-抗糜蛋白酶 (Alpha-1 Antichymotrypsin, ACT)** - 分子量: 60 kDa, pI: 5.3-5.5
13. **α1-脂蛋白 (Alpha-1 Lipoprotein, LPAI)** - 分子量: 25 kDa, pI: 4.5-5.0
14. **α2-抗纖溶酶 (Alpha-2 Antiplasmin, AP)** - 分子量: 76 kDa, pI: 5.2-5.6
15. **β2-微球蛋白 (Beta-2 Microglobulin, B2M)** - 分子量: 11.8 kDa, pI: 5.0-5.3
16. **補(bǔ)體C3 (Complement C3, C3)** - 分子量: 184.6 kDa, pI: 5.5-6.0
17. **補(bǔ)體C4 (Complement C4, C4)** - 分子量: 197 kDa, pI: 5.0-5.5
18. **觸珠蛋白 (Haptoglobin, HPX)** - 分子量: 85 kDa, pI: 5.3-6.3
19. **載脂蛋白A1 (Apolipoprotein A1, APOA1)** - 分子量: 28.3 kDa, pI: 5.5-6.0
20. **載脂蛋白A2 (Apolipoprotein A2, APOA2)** - 分子量: 17 kDa, pI: 5.0-5.4
21. **載脂蛋白B (Apolipoprotein B, APOB)** - 分子量: 512-550 kDa, pI: 5.0-5.5
22. **維生素D結(jié)合蛋白 (Vitamin D Binding Protein, Gc)** - 分子量: 52 kDa, pI: 5.0-5.5
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