磁微?；瘜W(xué)發(fā)光歷史、原理及展望
一、免疫化學(xué)發(fā)展歷史
免疫學(xué)的發(fā)展史起始于微生物學(xué)研究，于18世紀(jì)建立，19 世紀(jì)至 20 世紀(jì)中期進(jìn)入經(jīng)典發(fā)展期。這一時(shí)期，人們對免疫功能的認(rèn)識由人體現(xiàn)象的觀察進(jìn)入了科學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)期。20世紀(jì)初期到中期，進(jìn)入近代免疫學(xué)時(shí)期。從20世紀(jì)中期開始，真正進(jìn)入現(xiàn)代免疫學(xué)時(shí)期。現(xiàn)代免疫學(xué)的檢測基本歷經(jīng)了以下幾個(gè)過程，如圖1所示。
免疫學(xué)檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測，利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對檢測信號進(jìn)行放大和顯示，常被用于檢測蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)。各類免疫學(xué)檢測方法的性質(zhì)及發(fā)展?fàn)顩r詳見表格1。免疫診斷在臨床診斷中占據(jù)著非常重要的地位，但是從我國臨床免疫診斷現(xiàn)狀來看，其步伐都落后于發(fā)達(dá)國家，亟待改進(jìn)。
表1. 各類免疫檢測技術(shù)的性質(zhì)及優(yōu)缺點(diǎn)
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放射性免疫 | 酶聯(lián)免疫 | 化學(xué)發(fā)光 | 電化學(xué)發(fā)光 | 納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光 |
| 檢測靈敏度 | 10-15 | 10-13 | 10-15- 10-18 | 10-17 | 10-21 |
| 精密度（批間差） | ＞15% | 10%-15% | ＜10%-15% | 5% | ＜10% |
| 線性范圍 | 105 | 102 | 106-7 | 107 | 107 |
| 檢測時(shí)間 | 3-4小時(shí) | 2-3小時(shí) | 65分鐘 | 10分鐘 | 18-40分鐘 |
| 放射污染 | 有 | 無 | 無 | 無 | 無 |
| 操作 | 手工 | 手工/批量自動化 | 手工/全自動 | 全自動 | 全自動 |
| 有效期 | 2個(gè)月 | 6-12個(gè)月 | 12個(gè)月 | 12個(gè)月 | 12個(gè)月 |
| 定性/定量 | 定量 | 定性/半定量 | 定量 | 定量 | 定量 |
| 發(fā)展趨勢 | 環(huán)境污染，國內(nèi)處于衰退期；歐美已經(jīng)完全淘汰。 | 國內(nèi)處于成熟期；歐美處于衰退期。 | 國內(nèi)處于導(dǎo)入期和成長期；歐美處于成熟期。 | 可使用項(xiàng)目廣泛，羅氏專利技術(shù)。 | 各項(xiàng)目可隨機(jī)組合使用，國內(nèi)處于發(fā)展期。 |
化學(xué)發(fā)光技術(shù)是近二、三十年來發(fā)展起來的一種測定方式。該技術(shù)的原理是利用化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體（常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物），使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當(dāng)中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)會釋放等能級的光子，對光子進(jìn)行測定而進(jìn)行定量分析（見下圖）?；瘜W(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響從而提高了靈敏度，并且避免了放射分析造成的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。
二、化學(xué)發(fā)光免疫分析的特點(diǎn)及發(fā)展動向
化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）是一種高度敏感的微量測定技術(shù)，凡具有抗原性的物質(zhì)（包括半抗原）都可以用CLIA測定。CLIA起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代具備以下特點(diǎn) ：
①高度敏感，極限達(dá)10-17－10-19mol/L，遠(yuǎn)高于放射性免疫（RIA）、酶聯(lián)免疫（EIA）。與時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)相當(dāng)，但比TRFIA便宜。
②特異性強(qiáng)，重復(fù)性好CV＜10％。
③測定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級。
④試劑穩(wěn)定性好，無污染有效期12月。
⑤操作簡單，易于自動化。
磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將磁性分離技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、免疫分析技術(shù)三者結(jié)合起來的一種新興分析方法，其基本原理見圖3 。該技術(shù)充分利用了磁性分離技術(shù)的快速易自動化性，化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏度性，以及免疫分析的特異性，在生物分析領(lǐng)域展現(xiàn)了不可替代的作用。
磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測（雙抗夾心法）原理示意圖
為進(jìn)一步提高化學(xué)發(fā)光的檢測靈敏度，采用納米粒固定化酶標(biāo)抗體，可以提高單個(gè)抗原表面結(jié)合的酶標(biāo)抗體量，從而起到信號放大的作用，如下圖：
目前磁微?；瘜W(xué)分析免疫分析已經(jīng)應(yīng)用于管式化學(xué)發(fā)光免疫檢測項(xiàng)目以及電化學(xué)發(fā)光免疫檢測項(xiàng)目。管式化學(xué)發(fā)光作為目前發(fā)展最為迅速的化學(xué)發(fā)光檢測儀器，受到普遍的關(guān)注，其基本原理如下圖。
磁微粒管式化學(xué)發(fā)光儀器遠(yuǎn)離圖
三、用于免疫化學(xué)發(fā)光的磁性微球
雖然目前用于化學(xué)發(fā)光的磁微粒種類繁多，但是其中最基本的要求就是磁響應(yīng)快、單分散、粒徑均勻、懸浮性好、非特異吸附低、穩(wěn)定性好等，因此最常用的為磁性聚苯乙烯微球。目前全球磁微?；瘜W(xué)發(fā)光試劑主要為跨國公司壟斷，其中Dyna、JSR、Merk、GE等的磁性微球占有較大市場份額。今年來國內(nèi)亦涌現(xiàn)出一些磁性微球較為出色的公司，如PuriMag、海貍等。
能夠用于化學(xué)發(fā)光免疫分析的磁珠種類
按材質(zhì)分：
| 材質(zhì) | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
| 磁性瓊脂糖微球 |
1. 親水性強(qiáng)，溫和的條件容易洗脫，不至于引起酶失活或蛋白質(zhì)變性 2. 表面惰性，非特異性吸附低，受pH影響小 3. 容量大，具有開放性的支撐骨架 4. 組織相容性好 |
1. 機(jī)械性能和力學(xué)性能較差 2. 溶脹程度會隨溶劑性質(zhì)變化 |
| 磁性二氧化硅微球 |
1. 機(jī)械強(qiáng)度相對較強(qiáng) 2. 化學(xué)穩(wěn)定性較優(yōu) |
1. 硅膠自身結(jié)構(gòu)空隙較多，容易造成表面大量的水存積，增加了化學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性 2. 堿性條件下非常不穩(wěn)定 3. 存在較大的非特異性吸附性 |
| 磁性聚丙烯酰胺/聚丙烯酸類高分子微球 |
1. 具有較好的親水性 2. 良好的血液相容性 3. 與其他高分子化合物共聚，改善其力學(xué)性能和穩(wěn)定性 |
收縮過大，易產(chǎn)生縮孔 |
| 磁性聚苯乙烯微球 |
1. 機(jī)械強(qiáng)度高 2. 表面易功能化 3. 表面非離子相互作用弱 4. 交聯(lián)聚苯乙烯能夠在強(qiáng)酸強(qiáng)堿中保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu) 5. 微球粒徑大小可控 |
聚苯乙烯微球表面為疏水性，對某些蛋白存在非特異性，需要對表面進(jìn)行功能化修飾 |
按照官能團(tuán)分：
| 磁珠種類 | 常見活化方法 | 配體的反應(yīng)位點(diǎn) |
| 羥基磁珠 | CDI活化、溴化氰 | 氨基 |
| 羧基磁珠 | EDC活化，NHS活化 | 氨基 |
| 氨基磁珠 | 戊二醛活化 | 氨基 |
| 環(huán)氧基磁珠 | —— | 巰基、氨基 |
| NHS磁珠 | —— | 氨基 |
| SA磁珠 | 配體生物素標(biāo)記 | 生物素 |
羧基、氨基和鏈霉親和素磁珠是其中最常選用的表面功能化磁珠。
四、免疫化學(xué)發(fā)光的基本原理
針對化學(xué)發(fā)光檢測的不同原理，磁珠在化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的應(yīng)用主要表面為一下幾種形式：
方法一、 間接法
間接法就是包被抗原，然后用酶標(biāo)記的抗抗體檢測樣本中抗體，基本原理見下圖，適合于檢測對象是自身抗體的情況。間接法的優(yōu)點(diǎn)：相對較方便，只要變換包被抗原就可以檢測不同的項(xiàng)目。間接法的缺點(diǎn)：標(biāo)本中的特異性抗體會競爭性的結(jié)合抗原，使結(jié)果出現(xiàn)假陰性。
采用間接法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入樣本（含目標(biāo)抗體）孵育，清洗。
c)加入酶標(biāo)抗抗體孵育，清洗。
d)加發(fā)光底物，檢測信號。
方法二、捕獲法
血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會干擾IgM抗體的測定，因此測定IgM抗體多用捕獲法?；驹砣缦聢D所示，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG后測定特異性IgM。
采用捕獲法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)將抗人IgM抗體連接在固相載體上形成固相抗人IgM，洗滌。
b)加入稀釋的血清標(biāo)本中的IgM抗體被固相抗體捕獲洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
c)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合洗滌。
d)加入針對特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合洗滌。
e)加底物顯色，檢測信號。
方法三、固相抗原競爭法
競爭法，是指受檢抗體和酶標(biāo)抗體競爭性的與磁珠表面抗原結(jié)合。固相抗原競爭法基本原理如下圖所示。結(jié)合于固相載體的酶標(biāo)抗體與受檢抗體的量呈反比。若受檢樣本中無抗體，酶標(biāo)抗體能夠順利與抗原結(jié)合，出現(xiàn)強(qiáng)信號。若受檢樣本中有抗體，則競爭性的占去了酶標(biāo)抗體與抗原的結(jié)合，酶標(biāo)抗體的結(jié)合力減弱，信號強(qiáng)度減弱。
采用固相抗原競爭法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)磁珠表面固定特異性抗原。
b)加受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原的混合液孵育。
c)加發(fā)光底物，檢測信號。
方法四、雙抗夾心（兩步法）
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，基本原理如下圖所示。
采用雙抗夾心法（兩步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理
操作步驟：
a)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜。
b)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)問，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
c)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)。
d)加發(fā)光底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
方法五、雙抗夾心法（一步法）
在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hook effect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果（如下圖， 雙抗夾心法及雙位點(diǎn)一步法。缺點(diǎn)：假陰性）
采用雙抗夾心法（一步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理
采用雙抗夾心法（一步法）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，當(dāng)樣本中抗原量較多是，容易出現(xiàn)假陰性。
操作步驟：
a)磁珠表面固定一抗。
b)加樣本和酶標(biāo)二抗孵育，清洗。
c)加發(fā)光底物，檢測信號。
五、發(fā)展展望
磁微粒免疫化學(xué)發(fā)光因其特有的靈敏度，必將逐步替代現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光方法，成為抗原抗體免疫檢測中的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，隨著國內(nèi)醫(yī)院及檢測機(jī)構(gòu)的逐步更新?lián)Q代，必將迎來10年左右的快速成長期。
廈門普睿邁格生物科技有限公司致力于磁性納米和微球的研發(fā)和生產(chǎn)，目前生產(chǎn)的聚苯乙烯磁性微球可以滿足化學(xué)發(fā)光對磁性微球的需要。請瀏覽相關(guān)網(wǎng)頁：http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/purmaghomo/
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