成功應(yīng)用生物素（biotin）、親和素（avidin）和鏈霉親和素（streptavidin）的技術(shù)提示
streptavidin-biotin 系統(tǒng)是天然存在的蛋白質(zhì)-配體相互作用體系，已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)的檢測(cè)以及蛋白質(zhì)純化。avidin-biotin系統(tǒng)是一種簡(jiǎn)單而優(yōu)雅的系統(tǒng)，通過(guò)利用來(lái)源于雞蛋白的avidin對(duì)biotin（維生素B7）的高親和力來(lái)連接免疫測(cè)定中的蛋白質(zhì)。從細(xì)菌中分離的streptavidin同樣與biotin結(jié)合良好，但缺乏在avidin上發(fā)現(xiàn)的糖蛋白部分，因此顯示出較少的非特異性結(jié)合。在免疫測(cè)定中，用于定位或定量分析物的抗體和報(bào)告物如熒光染料或酶通常通過(guò)streptavidin/avidin-biotin偶聯(lián)。在這里，您將找到一些使用streptavidin-biotin親和系統(tǒng)時(shí)的有用提示。廈門(mén)普睿邁格生物技術(shù)有限公司的PuriMag G-Streptavidin和PuriMag G-Avidin在各類應(yīng)用中均有非常良好的表現(xiàn)。
雖然avidin和Streptavidin都以非常高的親和力結(jié)合生物素，但在一些應(yīng)用中使用avidin的主要問(wèn)題是高非特異性結(jié)合，這歸因于糖的存在和高pI。因此，使用Streptavidin或可選地保留相同生物素結(jié)合特性的去糖基化avidin可以防止顯著的非特異性結(jié)合。
2. Streptavidin-biotin as a versatile detection system
Streptavidin-biotin系統(tǒng)幾乎可以引入各種免疫測(cè)定中，先將抗體與biotin綴合，而后用Avidin or Streptavidin蛋白檢測(cè)。之后將其與廉價(jià)的商業(yè)來(lái)源廣泛的高質(zhì)量的各種熒光染料和酶綴合，有利于信號(hào)放大和增加靈敏度，但同時(shí)需要優(yōu)化抗體和綴合物的結(jié)合。
3. Choose the right buffer system when working with biotinylated antibodies
為了防止高背景和低信噪比，強(qiáng)烈建議在阻斷緩沖液和其他溶液中避免胎牛血清（FBS）或生物素。良好的替代品是0.1％-2.0％BSA.在蛋白質(zhì)印跡中，脫脂奶粉或酪蛋白應(yīng)限于初始阻斷步驟，因?yàn)闅埩舻纳锼貢?huì)干擾測(cè)定。在這種情況下，然后應(yīng)在TBS-Tween中制備抗體溶液，其與硝酸纖維素膜和PVDF膜均相容。如果背景仍然存在問(wèn)題，高純度的0.2％-6％酪蛋白可以改善結(jié)果。
4. Reducing interference from residual biotin in samples
當(dāng)使用Streptavidin-biotin系統(tǒng)時(shí)，有時(shí)可通過(guò)蛋白質(zhì)印跡觀察到非特異性條帶。對(duì)于組織和細(xì)胞裂解物尤其如此，因?yàn)樗鼈兛赡芎芯哂泄矁r(jià)結(jié)合的生物素作為輔因子的酶。在這些情況下，在與一抗孵育之前，增加緩沖液的離子強(qiáng)度（~0.5M NaCl）和/或進(jìn)行特定的生物素阻斷步驟是有用的。在這種情況下，通過(guò)使用PuriMag的鏈霉親和素瓊脂糖磁珠從酪蛋白中去除游離的生物素和生物素化的酶可以顯著增強(qiáng)靈敏度。
5. Biotinylation of cell surface for protein quantification
Streptavidin-biotin素系統(tǒng)可以成功地作為非侵入性技術(shù)用于化學(xué)標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，以直接、準(zhǔn)確地定量細(xì)胞表面表達(dá)、內(nèi)吞作用和各種質(zhì)膜受體和抗原的再循環(huán)。隨后可以使用ELISA或Western印跡定量與特定受體或抗原結(jié)合的生物素的量。該技術(shù)可快速且安全的替代放射性標(biāo)記的方案。
6. Protein biotinylation
當(dāng)制備用于生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)的試劑時(shí)，建議在研究系統(tǒng)下進(jìn)行優(yōu)化測(cè)定。這是因?yàn)檫x擇合適的間隔臂和將生物素與靶蛋白結(jié)合的正確化學(xué)方法可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重要的影響。蛋白質(zhì)生物素化最廣泛的方法是基于用生物素的琥珀酰亞胺（NHS）酯修飾蛋白質(zhì)中暴露的伯氨基。當(dāng)不可能修飾游離氨基時(shí)，如果蛋白質(zhì)含有游離硫醇基團(tuán)或者如果它們被糖基化，則蛋白質(zhì)仍然可以被生物素化。此外，還可以使用市售的光反應(yīng)生物素化試劑將蛋白質(zhì)生物素化，所述光反應(yīng)生物素化試劑在暴露于紫外光后活化。
7. Purification of biotinylated proteins
由于Streptavidin-biotin復(fù)合物需要強(qiáng)變性緩沖液來(lái)破壞它們的相互作用并釋放生物素，因此從Streptavidin蛋白中純化生物素化蛋白質(zhì)也會(huì)導(dǎo)致天然構(gòu)型和功能性質(zhì)的喪失。 為此，考慮使用設(shè)計(jì)用于以較低親和力結(jié)合生物素的抗生物素蛋白類似物，并允許在較溫和的條件下進(jìn)行洗脫。 或者，可使用生物素的環(huán)狀胍基類似物2-亞氨基生物素（2-iminobiotin），因?yàn)樗憩F(xiàn)出與Streptavidin的pH依賴性相互作用，這也促進(jìn)了在較溫和條件下的回收。 它在高pH下保持高親和力特異性結(jié)合，但在酸性pH值下相互作用很差。 或者，也可以使用具有可切割間隔臂的生物素。
8. Biotinylation including cleavable spacers
已經(jīng)引入了生物素的雙環(huán)與負(fù)責(zé)進(jìn)行蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)之間的可切割間隔臂的使用，目的是在固定化Streptavidin蛋白上捕獲后促進(jìn)生物素化蛋白質(zhì)的釋放。 這些技術(shù)可容易地從商業(yè)來(lái)源獲得，包括可通過(guò)還原劑如2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇和可光裂解的連接基團(tuán)破壞的二硫鍵。 然而，這些方法中的每一種都存在其自身的局限性，應(yīng)該針對(duì)特定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行仔細(xì)優(yōu)化。
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