免疫磁性微球的簡介、原理與應(yīng)用
免疫磁性分離技術(shù)是利用抗原抗體的高度特異性識別作用，使抗體（或抗原）固定于免疫磁性微球（IMMS）表面，形成固相抗體/抗原的復(fù)合物，經(jīng)外磁場作用后，復(fù)合物被滯留，磁性微球載抗原/抗體復(fù)合物與其他組分分離,從而達(dá)到分離目的。由于磁性微球代替其他固相載體用于免疫分離，不僅簡單易行，而且特異性高，損失小，還可將免疫分離與富集結(jié)合為一體。因此它在醫(yī)學(xué)、生物分離、食品衛(wèi)生檢測、環(huán)境檢測等諸多領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的研究與應(yīng)用前景。
一、磁性微球的簡介
1、磁性材料
磁性材料多為 Fe、Co 和 Ni等過渡金屬特定晶型的氧化物、混合氧化物及其水化物。在眾多磁性材料中，可供選擇使用的只有少數(shù)幾種：如 γ-Fe2O3，MeFe2O3（Me＝Co、Mn、Ni），F(xiàn)e3O4，Ni、Co、Fe、Fe-Co 和 Ni-Fe 合金等,其飽和磁化強(qiáng)度依次遞增，穩(wěn)定性卻依次遞減。目前最常用的磁性材料為Fe3O4磁粉或磁流體（magnetic fluid，或鐵磁流體，ferrofluid）。后者是含有超細(xì)磁性粒子（粒徑10～40nm）的混懸液，在外磁場作用下可在體內(nèi)定向移動聚集，靶向性較強(qiáng)，并可定期、安全地排出體外。此外，磁流體可吸收交變磁場中電磁波的能量轉(zhuǎn)化為熱能，使局部溫度升高而殺傷腫瘤組織。
2、磁性微球
磁性微球按組成的材料的不同，可分為無機(jī)微球、生物高分子微球、高分子微球等。就目前國內(nèi)外的研究狀況，磁性聚合物微球按結(jié)構(gòu)主要分為 3 大類：A.核-殼結(jié)構(gòu)，即磁性材料為核，聚合物為殼；B. 夾層結(jié)構(gòu)（也稱殼-核-殼結(jié)構(gòu)），即內(nèi)核為聚合物，中間層為磁性材料，外層為聚合物；C. 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即磁性材料分散于聚合物微球中（圖1）。
圖1 三種不同結(jié)構(gòu)的磁性聚合物微球
A.核殼結(jié)構(gòu) B.夾層結(jié)構(gòu) C.網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)
磁性材料 聚合物材料
Fig 1 The three structures of magnetic polymer microsperes magnetic materials polymer materials
A. core-rind structure B. samdwich structure C. reticulation structure
Fe3O4納米粒子在粒徑小于30nm時(shí)，具有超順磁性，即在沒有外界磁場作用時(shí)，沒有磁性；而存在外界磁場作用時(shí)，則極易被磁化；外界磁場撤銷后，又會在極短的時(shí)間內(nèi)退磁，沒有磁滯現(xiàn)象，矯頑力為零。超順磁性的出現(xiàn)可歸因?yàn)椋涸谛〕叽缦?，?dāng)各向異性能減小到與熱運(yùn)動能可相比擬時(shí)，磁化方向就不再固定在一個(gè)易磁化方向作無規(guī)律變化，結(jié)果導(dǎo)致超順磁性的出現(xiàn)。
3、聚合材料
常用的聚合物材料有白蛋白、明膠、球蛋白、酶類、聚賴氨酸、聚故氨酸、淀粉、葡聚糖、殼聚糖、阿拉伯膠、果膠、乙基纖維素、聚苯乙烯、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯脂、聚丙烯酸等，這些材料都具有一定的通適性，對人體無毒性。
4、磁性微球必須滿足的條件
（1）超強(qiáng)的順磁性，就是指在磁場的存在下能迅速聚集，離開磁場能夠均勻分散，不出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；
（2）合適的粒徑（粒徑小于30nm）且粒徑分布單分散，使微球有足夠強(qiáng)的磁響應(yīng)性，又不會因粒徑太大而發(fā)生沉降；
（3）具有豐富的表面活性基團(tuán)，以便微球可以和抗體/抗原偶聯(lián)，并在外磁場的作用下實(shí)現(xiàn)分離。
二、磁性微球的制備原理與方法
1、包埋法
包埋法是將磁性粒子分散于高分子聚合物溶液中，通過霧化、絮凝、沉積、蒸發(fā)等手段得到磁性聚合物微球。Gupta 等將磁性粒子與牛血清清蛋白和棉籽油進(jìn)行超聲處理，然后加熱至 105～150℃，得到外包牛血清白蛋白的磁性微球；一般而言，包埋法得到的磁性微球其磁性粒子（磁核）與外殼層的結(jié)合主要通過范德華力（包括氫鍵）、磁粒表面的金屬離子與聚合物鏈的螯合作用以及磁性粒子表面功能基與聚合物殼層功能基形成的共價(jià)鍵。利用包埋法制備磁性微球方法簡單，但所得的粒子粒徑分布寬、形狀不規(guī)、粒徑不易控制、殼層中難免混雜一些諸如乳化劑之類雜質(zhì)，用于免疫測定、細(xì)胞分離等領(lǐng)域會受到很大的限制。
2、單體聚合法
單體聚合法是在磁性粒子和單體存在下，加入引發(fā)劑、穩(wěn)定劑等聚合而成的核-殼結(jié)構(gòu)磁性聚合物微球。迄今為止，單體聚合法合成磁性微球的方法主要有：懸浮聚合、乳液聚合（包括無皂乳液聚合、種子聚合）、分散聚合等。單體聚合法成功的關(guān)鍵在于確保單體的聚合反應(yīng)在磁粒表面順利進(jìn)行。一般而言，磁性粒子為親水性，對于親水性單體如戊二醛，單體易接近磁性粒子，但對于大多數(shù)油性單體如苯乙烯、甲基丙烯酸甲脂等，據(jù)核反應(yīng)則難以在磁粒表面順利進(jìn)行。適當(dāng)改進(jìn)懸浮聚合的有機(jī)相組成，或?qū)Υ判粤Ｗ舆M(jìn)行表面處理，可使單體在磁粒表面順利聚合。
懸浮聚合法具有微球粒徑分布寬、粒徑較大、固載量小、并有不含磁性物質(zhì)空白球的缺點(diǎn)，但作為固定化酶的載體，有利于保持酶的活性，而且磁響應(yīng)性也較強(qiáng)。目前來說，采用乳液聚合法難以制備出粒徑大于 1μm的磁性聚合物微球，而當(dāng)磁性聚合物微球用于細(xì)胞分離、固定化載體領(lǐng)域時(shí)，為了能在磁場下快速分離，多希望磁性聚合物微球粒徑大于 1μm。
分散聚合法是指一種溶于有機(jī)溶劑(或水)的單體，通過聚合生成不溶于該溶劑的聚合物，而且形成膠態(tài)穩(wěn)定分散體系的聚合方式，這對于合成大粒徑、單分散性的磁性聚合物微球具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢，同時(shí)，該方法向微球表面引入功能基團(tuán)很方便。
3、共沉淀法
共沉淀法是指二價(jià)與三價(jià)鐵離子在堿性條件下沉淀生成 Fe3O4 或利用氧化-還原反應(yīng)生成 Fe3O4 的同時(shí)，利用聚合物材料（例如聚乙二醇、葡聚糖等）做分散劑，得到外包聚合物的磁性微球。共沉淀法得到的磁性微球通常粒徑較?。?10nm～100nm），因而具有較大比表面積和固載量。但其含磁量低，磁響應(yīng)性較弱，操作時(shí)需要較強(qiáng)的外加磁場[10]。
4、化學(xué)沉淀法
化學(xué)沉淀法是指將一定濃度的磁性金屬陽離子滲透和交換到大孔樹脂中去，然后利用化學(xué)反應(yīng)使金屬離子轉(zhuǎn)化為磁性金屬氧化物，使之均勻分布在聚合物的孔結(jié)構(gòu)中，滲透和轉(zhuǎn)化步驟可反復(fù)進(jìn)行；另一種方法是將樹脂硝化，然后在酸的存在下，用硝酸將金屬（如鐵）氧化成金屬氧化物，但這樣得到的磁性微球僅限于樹脂表面。
該方法操作簡便，樹脂中磁性分布均勻，磁含量容易控制，但對樹脂的要求比較嚴(yán)格。例如用一定比例的二價(jià)和三價(jià)鐵離子溶液浸泡陽離子交換樹脂，然后將樹脂置于堿性溶液中，使鐵離子轉(zhuǎn)化為Fe3O4，這兩步操作可以反復(fù)進(jìn)行。
三、免疫磁性微球的應(yīng)用
1、醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用
免疫磁性微球作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體，在外加磁場的作用下，將藥物載至預(yù)定區(qū)域，可使免疫磁性微球上的抗癌藥物更易與癌細(xì)胞接觸，提高了殺傷癌細(xì)胞的效果。Kharkevich 等將具有磁性的可溶性聚電解質(zhì)與含神經(jīng)肌肉麻醉劑的脂質(zhì)體的磁性藥物載體，用于貓?bào)w實(shí)驗(yàn)，取得了良好的效果。通過免疫磁性微球（IMMS）體外凈化骨髓已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于高劑量化療后的自體骨髓移植，取得了令人鼓舞的結(jié)果。至今已經(jīng)應(yīng)用于幾乎所有的需要進(jìn)行骨髓凈化的癌癥類型[12]。如神經(jīng)母細(xì)胞、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、小細(xì)胞癌、乳腺癌等。
2、生物分離方面應(yīng)用
免疫磁性微球分離方式有兩種：直接法，即用抗體包被磁性粒子，再與抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在磁場中與其它物質(zhì)分離；間接法，就是先用第二抗體包被磁珠，使磁珠成為第二抗體的載體，抗原與第一抗體結(jié)合后再加入帶有第二抗體的磁珠，磁珠上的第二抗體便與第一抗體結(jié)合，形成復(fù)合物，在磁場中該復(fù)合物得到分離。
免疫磁性微球技術(shù)可用來分離人類各種細(xì)胞，如紅細(xì)胞、外周血嗜酸/堿性粒細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，造血細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞等。在骨髓移植（BMT）的臨床實(shí)踐中，曾采用免疫磁性微球去除自體骨髓移植物中殘存癌細(xì)胞以降低白血病復(fù)發(fā)的機(jī)會，同樣的方法用于選擇性去除異體骨髓移植物中T細(xì)胞以防治移植抗宿主病（GVHD）的發(fā)生。免疫磁性微球在細(xì)胞分離方面還廣泛應(yīng)用于：分離純化特定細(xì)胞，進(jìn)行生理病理研究；用于白血病、艾滋病的治療；造血干細(xì)胞的分離純化以及遺傳病和腫瘤的基因治療等等。
此外，Nakamura 等把細(xì)菌磁微球用于分離血清中免疫球蛋白 IgG 的含量。 Fabregas 等將 IMMS 用磁場固定在一個(gè)平板換能器上，制得一種新型免疫傳感器，并將其應(yīng)用于流動分析系統(tǒng)，能夠分離出樣品中微摩爾級濃度的兔抗 IgG。
3、食品衛(wèi)生檢測方面應(yīng)用
免疫磁性分離技術(shù)不但廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，而且在食品衛(wèi)生檢測方面的應(yīng)用也初見端倪。沙門氏菌是引起食物中毒最常見的菌屬之一。Skjerve 等報(bào)道了用免疫磁性分離技術(shù)從乳及乳制品、肉類和蔬菜中分離出沙門氏菌，其檢測限為每克 1×102 個(gè)細(xì)菌。Seo 等將 FIA 與免疫磁性分離結(jié)合，測定接種于牛肉、蘋果汁和生牛奶中的低濃度大腸桿菌，每克牛肉中僅有 4 個(gè)大腸桿菌即可被檢出?？梢妼⒚庖叽判苑蛛x技術(shù)和其它檢驗(yàn)方法，如酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA），多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），熒光免疫分析（FIA），電子化學(xué)發(fā)光（ECL）相結(jié)合，可以數(shù)倍地提高分離效率和檢測極限。
4、環(huán)境檢測方面應(yīng)用
目前已經(jīng)嘗試將 IMMS 引入環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，用于對環(huán)境中自然水體、工業(yè)廢水、生活污水、土壤環(huán)境中部分有毒有機(jī)物、病毒、細(xì)菌的檢測。Yu. H成功地將 IMMS 應(yīng)用于快速分離食品及環(huán)境水體中的細(xì)菌和毒素，并將這種分離技術(shù)和熒光免疫分析法相結(jié)合，能夠快速探測出環(huán)境水體中 2×10-3 個(gè)/mL 的 E. coli O157，并能夠完成 96 個(gè)/h樣品的檢測。Sylvie 等研究用 IMMS 富集環(huán)境水體中的似隱菌屬擔(dān)孢子（一種能夠引起腸胃疾病的原生動物），然后采用 PCR 擴(kuò)增檢測技術(shù)進(jìn)行檢測，其檢測靈敏度達(dá)到能夠從每 100L水中檢出 1 個(gè)卵囊的水平。Lawruk 等用磁性微球酶聯(lián)免疫吸附法測定環(huán)境水樣及土壤中氰基丫嗪，同時(shí)選用 IMMS 作為 2，4-D 抗體固相，檢測環(huán)境水樣中的 2，4-D 及其酯類，該法靈敏度更高，檢出限可達(dá) 0.7μg/L。
四、小結(jié)
免疫磁性微球是免疫學(xué)與磁性微球技術(shù)結(jié)合的一類新型材料，其分離技術(shù)由于具有簡便、快速。分離純度高等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域。隨著免疫磁性分離技術(shù)的發(fā)展，必將使IMMS應(yīng)用到更加廣泛的領(lǐng)域。目前使用IMMS技術(shù)本身已日趨成熟，以后研究方向?qū)@以下問題。
1、磁響應(yīng)性與粒徑的關(guān)系
磁性微球的突出特點(diǎn)是其在外加磁場的作用下定向移動。未來磁性制備的目標(biāo)是獲得高磁響應(yīng)性、高比表面積、低密度、單分散的微球，或者尋求新的磁性材料作為磁核以及對磁核的特殊處理能有助于解決這一問題。
2、特定的抗原-抗體結(jié)合物
對于特定的抗原/抗體的快速分離與檢測，找到對應(yīng)的、具有最強(qiáng)親和力的抗體/抗原，使其形成穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物，且不影響其空間穩(wěn)定性及活性將會是未來研究的重點(diǎn)。
3、磁性微球的應(yīng)用
磁性微球應(yīng)用應(yīng)解決的問題是如何避免包覆的高分子層的分解以及磁性微球的再生，增長微球的使用壽命，使其能商業(yè)化生產(chǎn)。
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