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    目前LC-MS/MS項目包括內(nèi)源性小分子化合物（如維生素、激素、兒茶酚胺及其代謝物、氨基酸、膽汁酸等），外源性的小分子化合物（如臨床藥物、鼠藥、農(nóng)藥等）以及部分多肽和蛋白類標(biāo)志物（未包含蛋白質(zhì)酶解等特殊前處理方法）的定性或定量分析 ［ 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ］ 。

    建議1：樣品前處理技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過色譜質(zhì)譜原理、分析化學(xué)和藥物分析專業(yè)知識、儀器使用及維護、檢測項目、標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standard operating procedure，SOP）等專項培訓(xùn)，考核合格方可上崗。

    Ⅰ儀器的樣品前處理方式較為復(fù)雜，相比于Ⅰ儀器，Ⅲ儀器或可使用更簡便的樣品前處理方法即可滿足要求。臨床常見LC-MS/MS檢測項目推薦的樣品前處理方法及質(zhì)譜儀要求見 表1 。

建議2：樣品前處理方法選擇與儀器的靈敏度相關(guān)。濃度低或者質(zhì)譜離子化效率低的化合物，建議采用衍生化的方法提高化合物的離子化效率，或采用靈敏度更高的質(zhì)譜儀器。

2.輔助設(shè)備
（1）移液器：校準(zhǔn)合格的移液器。
（2）振蕩器：管式振蕩器，板式振蕩器。
（3）離心機：高速制冷離心機、板式制冷離心機，離心機應(yīng)校準(zhǔn)合格。建議使用中等及以上的離心力（如2 500× g/3 000× g），并根據(jù)項目特點選擇離心溫度，有利于實現(xiàn)較好的離心效果。
（4）氮吹裝置：根據(jù)檢測項目前處理需求，配備多孔氮吹儀，連接氮氣（空氣）源，以達到揮發(fā)溶劑、濃縮和提純樣品的目的。建議將氮吹裝置放于通風(fēng)櫥中，避免操作過程中可能存在的揮發(fā)性氣體損害風(fēng)險。氮氣源可為氮氣罐或質(zhì)譜配套的氮氣發(fā)生器中接出的氮氣。
（5）正/負壓裝置：正壓裝置配備氮氣（空氣）源，負壓裝置配備真空泵。
（6）移液工作站。
（7）含磁吸模塊的提取設(shè)備。
（8）其他。

建議3：實驗室應(yīng)根據(jù)待測物的理化性質(zhì)、生理水平、檢測精密度、靈敏度等要求，選擇合適的前處理方式和檢測儀器，實現(xiàn)可接受的性能要求和臨床預(yù)期用途。


（三）料：樣品前處理相關(guān)試劑與輔助耗材重點要求
1.試劑
臨床LC-MS/MS前處理常用試劑見 表2 。

2.配套的耗材
（1）容器：塑料離心管、96孔深孔板、上樣板、進樣瓶。
（2）過濾耗材：0.22 μm親水性聚四氟乙烯濾膜（polytetrafluoroethylene，PTFE）、0.22 μm親脂性聚四氟乙烯濾膜、蛋白沉淀板。
（3）萃取板：固相支撐液液萃取板（supported liquid extraction，SLE）、固相萃取板或固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）。
常見前處理方法及所需主要設(shè)備和耗材見 表3 。



建議4：鑒于液質(zhì)系統(tǒng)對于所使用的常見試劑、流動相化學(xué)級別和樣本的凈化程度要求較高，建議實驗室使用HPLC或LC-MS純度的試劑，并采用凈化程度較高的前處理方法，減少對液質(zhì)系統(tǒng)的損耗或污染。根據(jù)實驗室對檢測通量的要求，選擇經(jīng)濟高效的前處理設(shè)備（管式或板式）。

3.樣品采集活動的指導(dǎo)
    實驗室應(yīng)制定采集和處理原始樣品的程序，規(guī)定不同檢測項目所需的樣品類型、樣品體積、采集器械、保存劑及保存時間的要求，應(yīng)向樣品采集者提供相關(guān)信息和指導(dǎo)。臨床質(zhì)譜常見檢驗項目的樣本類型及保存條件見 表4 ，表中保存條件所列時間為常見保存時間，個別項目可能不穩(wěn)定，實驗室需進行檢測項目穩(wěn)定性的考察以確定最終添加劑和保存條件，如尿兒茶酚胺多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素的樣本在室溫24 h內(nèi)或4 ℃下5 d內(nèi)可優(yōu)先選擇硼酸（10 g/2 L尿液）進行防腐；50%乙酸（25 ml/2 L尿液）進行防腐時則需在4 ℃下3 d內(nèi)完成；尿兒茶酚胺中甲氧基腎上腺素類物質(zhì)樣本優(yōu)先選擇硼酸（10 g/2 L尿液）或50%乙酸（25 ml/2 L尿液）進行防腐；未添加防腐劑時4 ℃ 3 d內(nèi)完成。



（四）法：前處理方法原理及應(yīng)用

1.稀釋法（dilution method，DM）
原理：采用與LC-MS/MS兼容的樣品稀釋溶劑對樣品進行稀釋。
稀釋法是最簡單的樣品前處理方法，兼容性比較強，目標(biāo)分析物回收率高，具有操作簡單快速、樣本完整性好、成本低等優(yōu)點，缺點是選擇性差。稀釋法僅適用于基質(zhì)效應(yīng)小，濃度較高的目標(biāo)分析物，且樣品中不含或僅含很少大分子的簡單液體基質(zhì)，如尿液、淚液、腦脊液等。具體應(yīng)用實例見 附錄B.1 。

建議5：待測物濃度高且基質(zhì)成分簡單的體液樣本（尿液、淚液、腦脊液等）推薦采用稀釋法。


2.蛋白沉淀法（protein precipitation，PP）
原理：使用物理、化學(xué)、生物等手段使蛋白質(zhì)凝結(jié)成塊。蛋白質(zhì)沉淀常用的方法有以下幾種 ［ 14 ］ ：

（1）有機試劑：改變蛋白質(zhì)分子間的氫鍵，形成蛋白沉淀。
（2）中性高濃度鹽：使蛋白脫水形成沉淀。
（3）酸：在pH值低于蛋白質(zhì)的等電點時，強酸與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶性鹽沉淀。
（4）部分金屬鹽：金屬離子與蛋白質(zhì)的羧基形成不溶性的鹽沉淀。

    蛋白沉淀法是簡單、快速和應(yīng)用最廣泛的生物樣品前處理方法。生物樣品如血清、血漿和全血中含有豐富的可溶性蛋白，在樣品分析測定之前，首先必須去蛋白。許多方法可使蛋白質(zhì)變性，常見的蛋白沉淀劑以及用量詳見 表5 。


    蛋白沉淀適用于小分子目標(biāo)化合物。該樣品前處理方法，簡單、快速、適用于自動化和半自動化操作；但對于內(nèi)源性的小分子無選擇性，如色譜分離條件不恰當(dāng)，質(zhì)譜離子化效率可能會受到影響，基質(zhì)效應(yīng)也會比較明顯，且樣品濃度被稀釋。具體應(yīng)用實例見 附錄B.2 。

建議6：對于含有豐富可溶性蛋白的血清、血漿和全血樣本，測定小分子化合物時推薦采用蛋白沉淀法。推薦采用酸、金屬鹽、有機溶劑等作為沉淀劑與樣本按一定比例混合，渦旋混勻，離心取上清后上機檢測。

3.萃取法（extraction method，EM）
（1）常規(guī)萃取法（routine extraction，RE）原理：采用目標(biāo)分析物易溶解的試劑浸泡干血斑，從而使干血斑中的目標(biāo)分析物被萃取至試劑中。
    干血斑（dried blood spot，DBS）是多年來臨床中常用的樣品采集技術(shù)，業(yè)界對DBS技術(shù)的關(guān)注度也越來越高。它除了具有樣品體積小，容易采集、儲存、運輸?shù)葍?yōu)點外，還能夠有效提高樣本儲存穩(wěn)定性。DBS樣品常用的前處理方法為有機溶劑萃取，其操作簡單、快速、易于全自動化。具體應(yīng)用實例見 附錄B.3 。

（2）液液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）原理：基于目標(biāo)分析物在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)不同而進行分離或提取，臨床檢測項目通常將化合物從水相中萃取至與水不相溶的溶劑中。
    LLE是生物分析中最常用的樣品前處理技術(shù)之一，其靈活度高，對提取溶劑類型、pH、離子強度均可選擇，具有選擇性相對較高、成本低、可濃縮目標(biāo)分析物等優(yōu)點。但也存在不足，該方法不適用于親水性化合物；如果多個目標(biāo)分析物具有不同的親脂性，LLE開發(fā)難度較大；該方法操作較繁瑣，不易實現(xiàn)全自動化；重現(xiàn)性較差等。常用的萃取劑有甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷，或者一定比例的混合溶劑。LLE方法的開發(fā)需要根據(jù)目標(biāo)分析物的極性和溶解度選用合適的萃取劑，改變有機試劑，調(diào)節(jié)pH或者緩沖溶液的離子強度，可以有效地將目標(biāo)化合物從水相萃取至有機相中，將基質(zhì)中的其他成分留在水相中。具體應(yīng)用實例見 附錄B.4 。

（3）固液支撐萃取法（supported liquid extraction，SLE）原理：目標(biāo)分析物在有機試劑和吸附于固體載體上的水相之間的分配平衡。
    利用高表面積的惰性固體來提高水溶性樣品與萃取劑（水不相溶有機試劑）之間的接觸面。常用的萃取劑包括：MTBE、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷或者兩種溶劑的混合。生物樣品上樣后，加入萃取試劑，從固體載體表面萃取目標(biāo)分析物。SLE可借助96孔板實現(xiàn)高通量，且不會形成乳化液，目標(biāo)分析物的提取效率有所提高，更便于自動化。具體應(yīng)用實例見 附錄B.5 。

（4）固相萃取法（solid phase extraction，SPE）原理：與液相色譜分離原理基本相同，即基于樣品基質(zhì)各種組分在固定相和流動相兩相之中的分配系數(shù)不同，使目標(biāo)分析物與基質(zhì)中的干擾物質(zhì)分離并洗脫下來，同時濃縮目標(biāo)分析物。

    SPE小柱根據(jù)填料不同實現(xiàn)不同的分離模式（正相、反相、離子交換等）選擇性保留目標(biāo)分析物而使干擾物流出，從而達到樣品凈化的目的。表6 列出了常見的SPE類型、保留和洗脫機制及應(yīng)用。根據(jù)樣品前處理目的不同，SPE可實現(xiàn)除雜、脫鹽、使復(fù)雜樣品得到凈化，同時能濃縮目標(biāo)分析物，提高靈敏度。SPE具有從中等到高等的選擇性；并有良好的重現(xiàn)性；經(jīng)過SPE樣品前處理，能夠降低目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)；可同時完成樣品富集與凈化，大大提高檢測靈敏度。但是SPE成本高，操作步驟繁瑣，且需要復(fù)雜的正壓或者負壓裝置，SPE小柱或SPE板易出現(xiàn)液體滴落不均勻，篩板堵塞等現(xiàn)象。


    一些SPE廠家通過改變色譜系統(tǒng)研發(fā)了在線 SPE，實現(xiàn)了在線純化和濃縮樣品，該系統(tǒng)便于自動化，但是也存在不足：如復(fù)雜的色譜系統(tǒng)，方法開發(fā)和優(yōu)化難度大，成本高，且在線SPE存在篩板堵塞等現(xiàn)象，限制了其推廣應(yīng)用。

常見SPE流程表參見 表7 。具體應(yīng)用實例見 附錄B.6 。


建議7：根據(jù)待測物的不同理化性質(zhì)和極性特征，實驗室可以采用適當(dāng)?shù)妮腿》绞綄Υ郎y物和基質(zhì)其他成分進行分離，并綜合干擾物分離難度選擇合適的萃取載體，從常規(guī)萃取（干血斑）、液液萃取、固液萃取到固相萃取，樣本的凈化能力遞增。

4.磁珠法（magnetic bead extraction，MBE）
    磁珠法是近兩年涌現(xiàn)出來的新技術(shù)，其主要原理是在磁性材料表面包被固定相，在固定相上進行相應(yīng)的官能團修飾，根據(jù)磁珠抓取物質(zhì)的類別分為兩類：一類為吸附目標(biāo)分析物的磁珠，稱為富集磁珠；一類為吸附樣品中的雜質(zhì)的磁珠，稱為凈化磁珠。凈化磁珠的原理為磁珠與蛋白沉淀物理結(jié)合以及靜電吸附和配位結(jié)合，從而達到凈化樣品的作用。富集磁珠的原理同SPE方法相同，但與SPE相比，靈活度更高，成本較低，解決了SPE篩板堵塞的問題，其操作簡單，可實現(xiàn)全自動化。磁珠法的出現(xiàn)，大大推動了臨床質(zhì)譜前處理的自動化進程。具體應(yīng)用實例見 附錄B.7 。

建議8：對于有磁珠法試劑盒的檢測項目而言，建議在經(jīng)過實驗室性能驗證合格后采用。搭配全自動樣本前處理系統(tǒng)，將極大地提高樣本前處理的自動化水平。

5.超濾法（ultrafiltration，UF）
原理：使用濾膜過濾器或超濾離心管等裝置，利用過濾攔截的原理，根據(jù)分子大小，選擇性保留或者濾過溶液中的成分。

    超濾也可用于生物大分子的濃縮、純化、脫鹽等。超濾適合游離型（非結(jié)合）的小分子目標(biāo)化合物的分析，但超濾法成本相對較高。超濾應(yīng)保持一定的速率，超濾過程中，通過膜的游離部分從樣品中除去，導(dǎo)致蛋白結(jié)合部位積累，打破了最初的蛋白結(jié)合平衡，導(dǎo)致進一步的解離，建立新的平衡。因此應(yīng)當(dāng)控制超濾的速率和時間。另外，超濾過程中，建議采用生理條件（37 ℃、pH值7.4）和低至中等的離心力。超濾膜的孔徑應(yīng)該低于結(jié)合目標(biāo)化合物的蛋白質(zhì)的分子量，孔徑過大則雜質(zhì)過高，不能充分分離，孔徑過小則有效成分通透率較低，損失較大。具體應(yīng)用實例見 附錄B.8 。

建議9：在使用超濾法時，應(yīng)注意超濾的速率。超濾膜的孔徑應(yīng)該低于結(jié)合目標(biāo)化合物的蛋白質(zhì)的分子量，孔徑過大則雜質(zhì)過高，不能充分分離，孔徑過小則有效成分通透率較低，損失較大。超濾過程中，另外，應(yīng)控制超濾的條件和時間，如生理條件（37 ℃、pH 7.4）和低至中等的離心力。

6.平衡透析（equilibrium dialysis，ED）
原理：平衡透析是一種濃度驅(qū)動的分離技術(shù)。該技術(shù)允許低分子量溶質(zhì)通過合成聚合物或纖維素制成的半透膜從高分子中擴散分離出來。在透析過程中，要求使用生化成分盡可能接近血清/血漿離子環(huán)境的透析緩沖液；透析前將樣品緩沖至pH值為7.4，溫度為37 ℃，半透膜血清側(cè)游離激素與膜緩沖側(cè)激素之間形成濃度梯度，最終達到平衡。以游離甲狀腺素為例，已有研究表明，結(jié)合甲狀腺素和游離甲狀腺素之間的平衡取決于溫度和pH。當(dāng)溫度從20 ℃升高到37 ℃時，F(xiàn)T4的濃度增加一倍，因此如果真實反映體內(nèi)FT4濃度，則應(yīng)在37 ℃時進行。當(dāng)pH與7.4每相差0.1，則FT4測量濃度偏差3%~5%。具體應(yīng)用實例見 附錄B.9 。

建議10：PH值和溫度對于結(jié)合態(tài)激素和游離激素的平衡至關(guān)重要，應(yīng)在合適的pH值和溫度下進行透析操作。建議使用生化成分盡可能與血清/血漿離子環(huán)境接近的透析緩沖液。實驗室應(yīng)控制適當(dāng)?shù)木彌_液條件（如37 ℃、pH 7.4）。

7.免疫親和提?。╥mmunoaffinity extraction，IAE）
原理：免疫親和提取利用抗原和抗體間特異性分子識別的原理，使目標(biāo)分析物得到富集。

免疫親和提取可提高LC-MS/MS方法的檢測靈敏度和特異性，其檢測下限可達到pg/ml的水平。但目前多數(shù)待測物缺乏商業(yè)化的、針對性的抗體，成本較高。具體應(yīng)用實例見 附錄B.10 。質(zhì)譜前處理中不同方法適用樣品類型及優(yōu)缺點匯總見 表8 。



建議11：免疫親和提取中的親和柱需要平衡至室溫，再進行樣本提??；對于超過親和柱載量的樣本，需要減少上樣體積進行檢測。

8.衍生法（derivatization method，DM）
原理：衍生化技術(shù)是通過化學(xué)反應(yīng)將樣品中難以分析檢測的目標(biāo)化合物定量的轉(zhuǎn)化成另一易于分析檢測的化合物，通過后者的分析檢測可以對目標(biāo)化合物進行定性和（或）定量分析。衍生化的目的包括改善離子化效率，從而提高質(zhì)譜檢測的靈敏度；改善分離度，提升化合物在色譜上的保留能力；增強化合物的穩(wěn)定性等。具體應(yīng)用實例見 附錄B.11 。常見的衍生化試劑及衍生產(chǎn)物見 表9 ，衍生化與非衍生化的對比見 表10 。




建議12：衍生可以提高待測物穩(wěn)定性和分析靈敏度，但也有耗時耗力的劣勢，實驗室應(yīng)選擇合適的衍生試劑和條件，提高檢測效率。

（五）環(huán)：樣品前處理對環(huán)境的要求
    前處理操作應(yīng)在單獨的區(qū)域進行，在樣品前處理區(qū)配備足夠的通風(fēng)設(shè)施，必要時實施安全風(fēng)險評估。前處理過程中可能涉及到易揮發(fā)性的試劑（如甲醇、乙腈、正己烷、揮發(fā)性無機酸等）的操作時，應(yīng)在通風(fēng)櫥中完成。因外，充分考慮不同操作步驟可能存在的揮發(fā)性氣體損害風(fēng)險，還應(yīng)配備萬向排風(fēng)罩等通風(fēng)設(shè)備，以保障實驗室人員安全 ［ 13 ］ 。實驗室工作人員在操作過程中應(yīng)根據(jù)情況佩戴口罩、帽子和手套等。見光易分解的物質(zhì)，實驗操作間應(yīng)具備避光條件。應(yīng)配備消防器材、沖淋裝置、洗眼裝置以及急救箱等應(yīng)急裝備。送檢樣本如不能立刻處理，應(yīng)根據(jù)樣本類型和各項目的檢測需求，保存樣本。如部分檢測項目需要避光保存（如維生素）；常溫保存（如腎素濃度 ［ 15 ］ ）；冷藏保存（兒茶酚胺）；血漿樣本如不能立刻檢測，建議分裝保存，避免溶血。

建議13：實驗室應(yīng)注意前處理過程可能產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體、發(fā)熱、噪音等污染，配備良好的通風(fēng)、散熱或者隔音設(shè)備。有條件的實驗室可以設(shè)置獨立的前處理區(qū)域，與儀器區(qū)分離開，降低對其他儀器和人員的干擾。實驗室應(yīng)對環(huán)境中影響檢測結(jié)果的微生物污染、灰塵、電磁干擾、濕度、供電、溫度、聲音和振動等進行評估并設(shè)定相應(yīng)要求。

四、操作時重點注意事項和常見錯誤
（一）內(nèi)標(biāo)的加入：前處理前即加入同位素內(nèi)標(biāo)并充分平衡待測物和內(nèi)標(biāo)，用于校正樣本提取、HPLC進樣、質(zhì)譜離子化和檢測中產(chǎn)生誤差。
（二）樣本離心：樣本離心前保存溫度過高或離心力過大，導(dǎo)致樣本溶血或者破碎。
（三）抗凝劑：對于加入抗凝劑的樣本需要及時搖勻，防止出現(xiàn)血凝塊。
（四）樣本類型：血漿樣本的項目要選擇合適的抗凝劑，減少凝血形成；血清樣本應(yīng)評價分離膠是否對待測物檢測有影響。
（五）震蕩和離心：樣本前處理操作需要控制震蕩力度、離心力、離心時間等條件。
（六）環(huán)境溫度及避光：對于特殊項目，需要控制樣本前處理的環(huán)境溫度及光照條件等。
（七）樣本儲存：實驗室應(yīng)評估檢測項目的穩(wěn)定性，及時對樣品進行檢測，未能及時檢測的樣品應(yīng)儲存在適宜的溫度、濕度、避光等條件下。

五、樣本前處理的評價
選擇一種合適的前處理方法，就等于完成了分析工作的一半。然而并沒有一種前處理方法能適用于不同的待測物和不同的樣本類型。即使相同的待測物，不同的樣本類型，可能要采用不同的前處理方法。評價樣本前處理方法是否合理，必須考慮以下方面 ［ 16 ］ ：

（一）待測物的提取效率：樣本前處理方法提取率的高低，影響方法的靈敏度。
（二）待測物的基質(zhì)效應(yīng)：樣本前處理，是否能有效的去除影響檢測的干擾物，減少樣本的基質(zhì)效應(yīng)。
（三）待測物提取過程精密度：樣本前處理提取過程的精密度，直接影響檢測的靈敏度及準(zhǔn)確度。
（四）前處理的復(fù)雜程度：操作是否簡單、省時，前處理越復(fù)雜，步驟越多，待測物的損失越大，誤差也會越大。
（五）成本：在可滿足臨床檢測要求的前提下，盡量避免昂貴的儀器和試劑。

六、自動化發(fā)展
    近年來，臨床質(zhì)譜實驗室自動化發(fā)展迅速，尤其是樣品前處理的自動化。自動化樣品前處理設(shè)備的使用，可以顯著降低手工操作的誤差、提升分析精密度，還可以降低技術(shù)人員勞動強度，提升整體檢測效率。目前臨床質(zhì)譜的自動化尚處于起步階段，國內(nèi)企業(yè)和臨床實驗室 ［ 17 ］ 在樣品制備自動化方面的探索主要是半自動化或移液工作站的解決方案，尚未有全流程的自動化、信息化和集成化的質(zhì)譜檢測系統(tǒng)在臨床上應(yīng)用。半自動化的前處理設(shè)備，一般體積小，重量輕，占地面積小，成本相對較低，但是需要人為的干預(yù)相對比較多。國外大型儀器制造商開發(fā)了全自動前處理系統(tǒng)，如近期日本島津公司研發(fā)的全自動前處理系統(tǒng)CLAM TM-2030，可以自動完成血清樣本的去蛋白和衍生過程 ［ 18 ］ 。移液工作站一般體積較大，成本相對較高，人工干預(yù)比較少，對實驗人員的要求比較低，投入相對較高。

    隨著LC-MS/MS檢測技術(shù)在臨床逐漸被重視和認可，有關(guān)的科學(xué)技術(shù)研究也正在飛速進步，最終將逐步滿足臨床自動化和高通量的需求，提高對于臨床實驗室的適用性。目前，臨床實驗室可根據(jù)檢測項目的前處理需求、樣本量和經(jīng)濟成本等因素選擇合適的前處理設(shè)備，配備自動化前處理設(shè)備，以方便樣品的前處理。

七、結(jié)語和展望
    質(zhì)譜技術(shù)以其高靈敏度、高特異性優(yōu)勢在臨床檢驗領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，但其分析結(jié)果受樣品特性影響較大，因此需要綜合實驗室設(shè)備、試劑成本、目標(biāo)分析物的特性、檢測通量要求等因素來選擇合適的樣品前處理方法，在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提下，兼顧樣品前處理過程快速高效、批量化、自動化、環(huán)境友好、成本較低等考量因素。
    隨著質(zhì)譜技術(shù)在臨床應(yīng)用的不斷深入和前處理技術(shù)的不斷發(fā)展，新型的前處理技術(shù)尤其是自動化技術(shù)將逐漸被開發(fā)并應(yīng)用于臨床。生物樣品的分析有望實現(xiàn)從樣品的采集、處理、分離到分析的完全自動化。本共識通過文獻調(diào)研、用戶調(diào)查、專家咨詢收集的臨床問題，重點對現(xiàn)有臨床質(zhì)譜前處理技術(shù)的主要原理、選擇依據(jù)和臨床應(yīng)用進行了闡述，將適時修訂，以滿足臨床規(guī)范化應(yīng)用的需求。希望本共識推動解決臨床檢測樣品前處理規(guī)范化發(fā)展的問題，在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提下實現(xiàn)臨床檢測更高效、更經(jīng)濟、更快捷的前處理過程。

工作組：
執(zhí)筆人：周偉燕（北京醫(yī)院 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心）
專家組成員（按姓氏拼音排序）：曹正（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗科），陳發(fā)林（福建省臨床檢驗中心），崔瑞芳（長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院），鄧宇航（國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心），杜璟（浙江省人民醫(yī)院檢驗科），方慧玲（上海市臨床檢驗中心），顧大勇（深圳第二人民醫(yī)院），黃憲章（廣東省中醫(yī)院檢驗科），胡敏（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗科），蔣黎（四川省人民醫(yī)院檢驗科），居漪（上海市臨床檢驗中心），李伯安（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心檢驗科），李寧（北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司），李水軍（上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中心實驗室），劉珍妮（國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心），龍琪?。ㄖ心洗髮W(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗科），馬曉麗（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科），馬紫嘉（國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心），歐啟水（福建醫(yī)科大學(xué)附屬**醫(yī)院），邱玲（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科），孫志（鄭州大學(xué)**附屬醫(yī)院藥學(xué)部），王愷雋（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 阜外醫(yī)院實驗診斷中心），夏駿（浙江省人民醫(yī)院檢驗科），禹松林（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科），張傳寶（北京醫(yī)院 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心），張鈞（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院），張鵬偉（廣東省中醫(yī)院檢驗科），章申燕（北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司），趙蓓蓓（廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司質(zhì)譜中心），周偉燕（北京醫(yī)院 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心），周洲（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 阜外醫(yī)院實驗診斷中心），鄒迎曙（北京市醫(yī)療器械檢驗研究院 體外診斷檢驗室）

附錄B：前處理方法應(yīng)用典型實例 以下實例僅供參考。

B.1稀釋法
典型實例：LC-MS/MS方法測定尿液樣品中的肌酐含量 ［ 19 ］ 。
（1）96孔板中加入200 μl的同位素內(nèi)標(biāo)的乙腈工作液。
（2）加入40 μl的樣品、校準(zhǔn)樣品或質(zhì)控樣品，密封后渦旋混勻3 min。
（3）3 000× g離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至96孔板中，然后注入LC-MS/MS進樣分析。

B.2蛋白沉淀法
典型實例：LC-MS/MS方法測定人血清中伏立康唑、泊沙康唑、氟康唑和伊曲康唑 ［ 20 ］ 。
（1）取100 μl的樣品、校準(zhǔn)樣品或質(zhì)控樣品，加入200 μl含 0.1%甲酸乙腈的沉淀劑（僅供參考）和100 μl的內(nèi)標(biāo)溶液（乙腈），渦旋混勻。
（2）17 000× g離心10 min，去除蛋白質(zhì)。取上清液50 μl，然后補加100 μl 50%甲醇水溶液。渦旋混勻，上機。

B.3常規(guī)萃取法
典型實例：新生兒遺傳代謝病篩查 ［ 21 ］ 。
（1）用打孔器將采集的高低水平質(zhì)控血斑及待測樣本血斑打出3 mm直徑的血片，按順序置于96孔板中，然后每孔加入100 μl內(nèi)標(biāo)工作液（溶劑信息未提供）。
（2）密封，在45 ℃條件下孵育震蕩（130~150 g）45 min然后轉(zhuǎn)移萃取液75 μl至上樣板中，進樣分析。

B.4液液萃取
典型實例：LC-MS/MS方法測定人血清樣品中脂溶性維生素 ［ 22 ］ 。
（1）取200 μl的血清樣品加入到塑料離心管中，然后加入30 μl的乙酸視黃醇（保護劑），最后加入800 μl的甲醇溶液（含有同位素內(nèi)標(biāo)），密封，渦旋混勻30 s。
（2）16 000× g離心10 min，然后收集上清液，加入800 μl的正己烷，渦旋混勻；此步驟可重復(fù)2次，從而提高目標(biāo)分析物的提取回收率。
（3）收集正己烷層，并在45 ℃的真空條件下蒸發(fā)至干。
（4）將殘留物溶于100 μl甲醇中，進樣分析。

B.5固液支撐萃取
典型實例：LC-MS/MS法測定人血漿中醛固酮 ［ 23 ］ 。
（1）取450 μl的血漿樣品、校準(zhǔn)品或質(zhì)控品，然后加入450 μl的50%甲醇配制的同位素內(nèi)標(biāo)溶液，劇烈渦旋混勻。
（2）將上述溶液800 μl轉(zhuǎn)移至SLE板，然后靜置5 min。
（3）分兩次加入2.5 ml的MTBE萃取劑進行洗脫，然后將有機試劑在氮氣下吹干。
（4）120 μl的35%的甲醇/水復(fù)溶，上機檢測。

B.6固相萃取
典型實例：LC-MS/MS法測定人血清或血漿中的類固醇激素 ［ 24 ］ 。
（1）取100 μl血清或血漿樣品，然后加入10 μl混合內(nèi)標(biāo)工作液（甲醇），最后加入100 μl甲醇溶液，渦旋混勻1 min。
（2）補加100 μl蒸餾水，渦旋混勻，然后離心，移取200 μl上清進行SPE的程序。
（3）SPE程序（僅供參考，實驗室可自行設(shè)計方法）：
a. 活化和平衡：親水親脂平衡SPE柱（簡稱HLB）中先后加入200 μl甲醇和水。
b. 上樣：將200 μl樣品上清溶液加入已活化的SPE提取板中。
c. 淋洗：加入200 μl甲醇：水（1∶9，V/V）進行一次淋洗，然后再加入200 μl的正己烷溶液分別進行第二次淋洗。
d. 洗脫：加入40 μl乙腈：甲醇（9∶1，V/V）進行洗脫，收集洗脫液，然后向收集板中加入60 μl蒸餾水。

B.7磁珠法
典型實例：LC-MS/MS法測定人血漿中的兒茶酚胺及其代謝物 ［ 17 ］ 。
（1）準(zhǔn)備含有磁珠（活化液）、平衡液、漂洗液和洗脫液的96孔預(yù)分裝板。
（2）在96孔預(yù)分裝的樣品列加入400 μl的樣本，然后再加入400 μl的同位素內(nèi)標(biāo)溶液。
（3）將加入樣品的96孔預(yù)分裝板加入到全自動樣品處理系統(tǒng)（如EX-48），儀器自動進行磁珠的活化、平衡、吸附目標(biāo)分析物、漂洗、洗脫等過程。
（4）完成提取程序，上機檢測。

B.8超濾法
典型實例：LC-MS/MS法測定人血清中游離睪酮 ［ 25 ］ 。
（1）樣品稀釋：取500 μl的血清加入500 μl的4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖液稀釋血清。
（2）超濾離心：將上述樣品加入到超濾裝置中，然后1 800× g，25 ℃，離心1 h。
（3）加入內(nèi)標(biāo)：將40 fmol睪酮的同位素內(nèi)標(biāo)加入到超濾液中，渦旋混勻，孵育5 min。
（4）游離睪酮的萃取：向超濾液中加入1 ml的甲基叔丁基醚（MTBE）萃取，40 ℃氮氣下?lián)]干。
（5）去除雜質(zhì)：1 ml的90%的甲醇重組，加入1 ml的庚烷，將底部的甲醇加入到潔凈管中，氮氣吹干。
（6）重組上機：70 μl的50%的甲醇復(fù)溶，上機檢測。

B.9平衡透析
典型實例：LC-MS/MS法測定游離甲狀腺激素 ［ 26 ］ 。
（1）透析緩沖溶液配制：按照CLSI C45A指南的建議配制HEPES透析緩沖溶液。
（2）加樣：96孔透析板中藍色一側(cè)加入200 μl的透析緩沖液，透明一側(cè)加入200 μl的樣本或質(zhì)控樣本。
（3）透析：將透析裝置放入37 ℃恒溫孵育箱中，旋轉(zhuǎn)17~19 h，完成透析。
（4）平衡至室溫：從孵育箱中取出透析板在室溫平衡30 min。
（5）加入同位素內(nèi)標(biāo)：取150 μl的透析液加入到96孔板中，然后加入200 μl的同位素內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻。
（6）校準(zhǔn)曲線配制：取150 μl的校準(zhǔn)品加入200 μl的同位素內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻。
（7）上機檢測：將樣本和校準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)移至上樣板中，進行LC-MS/MS分析。

B.10免疫親和提取
典型實例：LC-MS/MS法測定人血清中1，25-雙羥維生素D ［ 27 ］ 。
（1）免疫萃?。合蛎總€含200 μl的固定抗體的反應(yīng)杯中加入500 μl 的血清樣品，加入25 μl的內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻孵育60 min。
漂洗：加入500 μl的水漂洗三次，5 000 × g離心1 min。
（2）洗脫：加入400 μl的乙醇洗脫。
（3）氮吹重組：洗脫液真空干燥，加入（7∶3，V/V）的甲醇水重組上機分析。

B.11衍生法
典型實例：LC-MS/MS法測定干血斑中的氨基酸和?；鈮A ［ 28 ］ 。
（1）取1~2個濾紙血點（直徑3 mm的干血濾紙片，相當(dāng)于3.2 μl全血），置于96孔過濾板中，每孔加入含氨基酸和?；鈮A同位素內(nèi)標(biāo)的無水甲醇100 μl，室溫放置20 min，以提取血片中的氨基酸和酰基肉堿。然后離心轉(zhuǎn)移上清至另一個96孔板中，氮氣保護下50 ℃吹干，加入60 μl正丁醇（含3 mol/L HCl），密封，65 ℃孵育15 min進行衍生化。
（2）衍生后的溶液，在氮氣保護下50 ℃吹干。用100 μl 流動相（一般為乙腈∶水∶甲酸=80∶20∶0.02）復(fù)溶，取20 μl進樣，上機分析。

參考文獻

[1]Kim YJ, Lee SY, Hur M. Back to the Basics of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry[J]. Ann Lab Med, 2022, 42(2):119-120. DOI: 10.3343/alm.2022.42.2.119.
[2]Rappold BA. Review of the Use of Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Clinical Laboratories: Part I-Development[J]. Ann Lab Med, 2022, 42(2):121-140. DOI: 10.3343/alm.2022.42.2.121.
[3]Rappold BA. Review of the Use of Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Clinical Laboratories: Part II-Operations[J]. Ann Lab Med, 2022, 42(5):531-557. DOI: 10.3343/alm.2022.42.5.531.
[4]馮健男, 杜守穎, 白潔, 等 . 生物樣品前處理的研究進展[J].中國中藥雜志, 2014, 39(21):4143-4148.
[5]Kole PL, Venkatesh G, Kotecha J, et al. Recent advances in sample preparation techniques for effective bioanalytical methods[J]. Biomed Chromatogr, 2011, 25(1-2): 199-217. DOI: 10.1002/bmc.1560.
[6]Zhou W, Li H, Dong J, et al. Serum cholesterol measured by isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Clin Chem Lab Med, 2011, 49(4): 669-676. DOI: 10.1515/CCLM.2011.093.
[7]中國醫(yī)師協(xié)會檢驗醫(yī)師分會臨床質(zhì)譜檢驗醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會, 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜臨床檢測方法的開發(fā)與驗證[J]. 檢驗 醫(yī) 學(xué) , 2019, 34(3): 189-196. DOI: 10.3969/j. issn.1673-8640.2019.03.001.
[8]王嫻, 常穎, 王佳佳, 等 . 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人血清中總膽堿[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 45(09):833-835. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2011.09.015.
[9]劉琳, 許正文, 孟蘭蘭, 等 . 液相串聯(lián)質(zhì)譜在婦幼健康領(lǐng)域的應(yīng) 用 與 挑 戰(zhàn) [J]. 中 華 預(yù) 防 醫(yī) 學(xué) 雜 志 , 2022, 56(10): 1520-1526. DOI: 10.3760/cma.j.cn112150-20220329-00298.
[10]劉仲, 于志剛, 王艷華, 等 . 人尿液中 8-羥基脫氧鳥苷的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志 , 2016, 50(4): 357-361. DOI: 10.3760/cma. j. issn.0253-9624.2016.04.014.
[11]Liu Z, Jin L, Zhang J, et al. Development of a designed comparison method based on isotope dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determining plasma renin activity and its clinical assessment of renin activity stability in plasma[J]. Anal Methods, 2023, 15(4): 492-501. DOI: 10.1039/d2ay 01646j.
[12]Deng Y, Zhang C, Wang J, et al. An Accurate Isotope Dilution Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method for Serum C-Peptide and Its Use in Harmonization in China[J]. Ann Lab Med, 2023, 43(4): 345-354.DOI: 10.3343/alm.2023.43.4.345.
[13]中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會臨床生化檢驗學(xué)組, 中國醫(yī)學(xué)裝備協(xié)會檢驗醫(yī)學(xué)分會 . 醫(yī)療機構(gòu)臨床質(zhì)譜實驗室建設(shè)共識[J]. 中 華 檢 驗 醫(yī) 學(xué) 雜 志 , 2023, 46(8): 783-791. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20221122-00696.
[14]戴國梁, 居文政, 談恒山 . 生物樣品前處理研究進展[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2013, 33(6):484-487.DOI: 10.13286/j.cnki. chinhosppharmacyj.2013.06.026.
[15]Sealey JE, Gordon RD, Mantero F. Plasma renin and aldosterone measurements in low renin hypertensive states[J]. Trends Endocrinol Metab, 2005, 16(3): 86-91. DOI: 10.1016/j.tem.2005.02.006.
[16]Clinical and Laboratory Standards Institute. CLSI Document C62-A: liquid chromatography-mass spectrometry methods; approved guideline[S]. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014.
[17]Yu S, Zhou W, Yu J, et al. An automated magnetic bead extraction method for measuring plasma metanephrines and 3-methoxytyramine using liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem, 2022, 414(11):3541-3549. DOI: 10.1007/s00216-022-03984-x.
[18]Ueyanagi Y, Setoyama D, Kawakami D, et al. Fully Automated Quantitative Measurement of Serum Organic Acids via LC-MS/MS for the Diagnosis of Organic Acidemias: Establishment of an Automation System and a Proof-of-Concept Validation[J]. Diagnostics (Basel), 2021, 11(12):2195.DOI: 10.3390/diagnostics11122195.
[19]Leonard M, Dunn J, Smith G. A clinical biomarker assay for the quantification of d3-creatinine and creatinine using LC-MS/MS[J]. Bioanalysis, 2014, 6(6):745-759. DOI: 10.4155/bio.13.323.
[20]Xiao Y, Xu YK, Pattengale P, et al. A Rapid High-Performance LC-MS/MS Method for Therapeutic Drug Monitoring of Voriconazole, Posaconazole, Fluconazole, and Itraconazole in Human Serum[J]. J Appl Lab Med, 2017, 1(6): 626-636. DOI: 10.1373/jalm.2016.022756.
[21]楊應(yīng)松, 鐘志來, 李秋麗,等 . 串聯(lián)質(zhì)譜在新生兒遺傳代謝性疾 病 篩 查 中 的 應(yīng) 用 [J]. 實 用 醫(yī) 技 雜 志 , 2018, 25(12): 1350-1351.DOI: 10.19522/j.cnki.1671-5098.2018.12.012.
[22]Konieczna L, Ka?mierska K, Roszkowska A, et al. The LC-MS method for the simultaneous analysis of selected fat-soluble vitamins and their metabolites in serum samples obtained from pediatric patients with cystic fibrosis[J]. J Pharm Biomed Anal, 2016, 124: 374-381. DOI: 10.1016/j.jpba.2016.03.021.
[23]Meunier C, Blondelle D, Faure P, et al. Development and validation of a method using supported liquid extraction for aldosterone determination in human plasma by LC-MS/MS[J]. Clin Chim Acta, 2015, 447: 8-15. DOI: 10.1016/j.cca.2015.05.007.
[24]Jia Y, Liu X, Xu L, et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry measurement of 26 steroid hormones in human serum and plasma samples[J]. J Sep Sci, 2021, 44(12):2358-2370. DOI: 10.1002/jssc.202100091.
[25]Chen Y, Yazdanpanah M, Wang XY, et al. Direct measurement of serum free testosterone by ultrafiltration followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Clin Biochem, 2010, 43(4-5):490-496.DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2009.12.005.
[26]William Wu W, McPhaul MJ, Wu Z. Quantitation of Free Thyroxine by Equilibrium Dialysis and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J]. Methods Mol Biol, 2022, 2546: 485-492. DOI: 10.1007/978-1-0716-2565-1_43.
[27]Yuan C, Kosewick J, He X, et al. Sensitive measurement of serum 1α, 25-dihydroxyvitamin D by liquid chromatography/tandem mass spectrometry after removing interference with immunoaffinity extraction[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2011, 25(9): 1241-1249. DOI: 10.1002/rcm.4988.
[28]中國醫(yī)師協(xié)會檢驗醫(yī)師分會臨床質(zhì)譜檢驗醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會 . MS/MS技術(shù)在新生兒氨基酸、有機酸及脂肪酸氧化代謝障礙性疾病篩查中的應(yīng)用共識[J]. 檢驗醫(yī)學(xué), 2019, 34(6): 479-485. DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2019.06.001.