糖肽和糖蛋白分離富集方法精要必看
前言
蛋白糖基化在細胞粘附、代謝以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中都發(fā)揮著重要的作用，并且糖蛋白的異常糖基化與某些疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。此外，單克隆抗體等生物藥上連接的聚糖對于藥物的特性，如體內(nèi)循環(huán)半衰期、細胞毒性等有著重大的影響。因此，蛋白質(zhì)糖基化分析已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。
雖然目前在糖蛋白的質(zhì)譜分析（推薦在質(zhì)譜分析中使用 NEB 研發(fā)的胰蛋白酶酶切的 BSA MS 標準）方面已經(jīng)有了突出的進展，使得糖蛋白糖基化位點鑒定、聚糖結(jié)構(gòu)表征以及糖蛋白鑒定和定量成為可能，但復(fù)雜樣本中的蛋白糖基化分析仍然是一項艱巨的任務(wù)。這是由于在糖蛋白水解消化后，與獲得的肽含量相比，糖肽的比例較低，糖肽的質(zhì)譜信號被肽掩蓋或干擾，并且糖肽具有高度異質(zhì)性。因此，近年來，研究者們一直致力于開發(fā)糖肽富集和分離策略，以促進和改善復(fù)雜樣品中的糖蛋白的糖基化分析。本文總結(jié)了可用于從復(fù)雜樣品中富集/分離糖蛋白/糖肽的不同方法。
免疫親和色譜法
在血清或血漿的分析過程中，通常會在糖組學(xué)或糖蛋白質(zhì)組學(xué)測量之前，利用免疫親和色譜柱去除大部分蛋白。然而，由于聚糖是弱抗原，很難獲得具有足夠親和力和特異性的抗聚糖抗體以用于富集目的。
凝集素親和層析法
凝集素親和層析法是糖蛋白富集的主要方法，也常用于糖肽的富集分離。凝集素是一組多樣化的蛋白，可識別并可逆地結(jié)合特定糖基團，對于不同的聚糖結(jié)構(gòu)（不同連接的唾液酸、高甘露糖結(jié)構(gòu)、巖藻糖基化等）具有不同程度的選擇性結(jié)合能力，從而可用于糖蛋白的濃縮與分級分離，以及凝集素芯片的制作（NEB 最新推出的灰黑擬牛肝菌凝集素（BGL）可用于從復(fù)雜樣品中富集末端為 N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）的 N-聚糖或粘蛋白型 O-糖肽）。通常將凝集素固定在瓊脂糖、二氧化硅或多羥基聚合物等支持物上使用。由于單個凝集素的親和力使其無法結(jié)合整個糖蛋白質(zhì)組，使用幾種具有不同結(jié)合特異性的凝集素以實現(xiàn)更完整覆蓋的綜合富集策略引人青睞。
圖 1：NEB 的 BGL 結(jié)合位點示意圖。
酰肼法
酰肼法是另一種常見的糖蛋白和糖肽富集方法。在這種方法中，聚糖的順式二羥基被高碘酸鹽氧化，然后與固定有酰肼基團的樹脂發(fā)生共價偶聯(lián)（酰肼磁珠|Hydrazide magnetic beads-生物磁珠專家）。與凝集素親和法相反，酰肼捕獲是非特異性的，可以富集所有糖綴合物。糖蛋白的酰肼捕獲之后需要進行蛋白的水解消化、非糖肽的去除洗滌和利用糖苷酶 PNGase F（NEB 提供 PNGase F、重組型 PNGase F，快速 PNGase F，以及攜帶有 CBD 標簽的 Remove-iT? PNGase F）釋放 N聚糖。雖然酰肼捕獲是非特異性的，但捕獲糖肽的回收和下游分析卻受到釋放方法的限制。盡管研究者們不斷努力改進方法以應(yīng)用于 O-連接糖肽，酰肼法目前主要用于 N-連接糖肽的富集分離。
圖 2：酰肼法富集糖肽的化學(xué)反應(yīng)原理示意圖。
硼酸法
硼酸法被用于糖蛋白或糖肽富集，是因為它能夠與含 1-2 和 1-3 順式二羥基的糖類（例如甘露糖、葡萄糖和半乳糖）發(fā)生共價但可逆的化學(xué)反應(yīng)，進而形成穩(wěn)定的環(huán)酯。硼酸識別聚糖是非特異性的，即可以識別有各種分支的聚糖，也可以識別線性聚糖，還可以識別單糖，從而能夠無偏嗜地富集各種 N-和 O-連接的糖肽。Purimag的苯硼酸磁珠可以用于糖肽富集（糖蛋白純化磁珠|糖肽純化磁珠|硼酸磁珠|含二醇化合物純化||BA磁珠-生物磁珠專家）。
圖 3：硼酸法富集糖肽的化學(xué)反應(yīng)原理示意圖。
二氧化鈦（TiO2）富集法
TiO2 因其對唾液酸的親和力而被用于糖肽富集（磷酸化多肽富集磁珠|硅基TiO2磁珠|二氧化鈦磁珠-生物磁珠專家）。由于磷酸肽和糖肽都與 TiO2 結(jié)合，因此通過磷酸酶（NEB 提供 Lambda 蛋白磷酸酶可用于蛋白去磷酸化）預(yù)處理去除磷酸修飾有利于提高糖肽的富集效率。這種對唾液酸的特異性識別特別有吸引力，是因為有越來越多的報道認為癌癥發(fā)展、肝炎和炎癥與聚糖的唾液酸化有關(guān)。
親水作用液相色譜（HILIC）
HILIC 是一種很有前景的分離及富集方法，能分離糖蛋白及來源于糖蛋白的的糖肽和聚糖。HILIC 的特點是使用基于陽離子交換、陰離子交換、兩性離子相互作用和瓊脂糖凝膠的親水固定相，和相對疏水的有機流動相。由于結(jié)構(gòu)中具有親水性的碳水化合物部分的影響，糖肽能夠被更牢固地結(jié)合在 HILIC磁珠（HILIC磁珠 MagStart-HILIC——高結(jié)合量蛋白質(zhì)組學(xué)前處理MagReSyn?-HILIC-生物磁珠專家）上，從而與糖蛋白水解消化產(chǎn)物中的非糖基化肽發(fā)生分離。糖肽中寡糖的親水性使其成為 HILIC 分離的絕佳對象。
多孔石墨化碳（PGC）法
PGC 是一種用于聚糖和糖肽分離和固相萃?。⊿PE）的高效材料。在使用固相萃取柱分離的過程中，糖肽被保留，而非糖肽流出，以達到分離的目的。對于由非特異性或廣譜特異性蛋白，如蛋白酶 K（推薦使用NEB自主研發(fā)的蛋白酶 K，或者熱敏蛋白酶 K） 或鏈霉蛋白酶制備的短肽，PGC 分離是一種非常有效的方法。此外，這種方法已被證明在分離多糖異構(gòu)體方面非常有效。
其他
此外，還有其他一些材料或技術(shù)已被成功地應(yīng)用于糖蛋白質(zhì)組學(xué)中的分離富集過程，如通過在目標分子上進行氟化碳標簽衍生，然后利用連接氟化碳的固定相實現(xiàn)對聚糖的分離純化，清除可能會干擾質(zhì)譜分析的蛋白、去污劑和鹽；兩性離子親水性材料 Click TE-Cys 因其獨特的表面結(jié)構(gòu)和電荷分布，具有很高的親水性，能夠從人類血清蛋白中高效分離 N-聚糖，有效去除共存的鹽和內(nèi)源性血清肽；過濾輔助樣品制備法通過選擇合適的截流分子量清除生物樣本中的裂解緩沖液和代謝污染物；由于納米材料優(yōu)越的物理化學(xué)特性，例如大的比表面積、功能化能力和出色的機械性能，以及其熱和電性能，已經(jīng)被多次應(yīng)用于糖基化分析之中。
總結(jié)
近年來，許多研究者們致力于開發(fā)和改進用于糖肽分析的富集和分離方法，這些方法可以被歸類為有偏嗜的方法（如凝集素法和 TiO2 法），適用于特定糖肽的富集；或無偏嗜的方法（酰肼法、硼酸法、PGC 法 或大多數(shù)的 HILIC 法），可以用于富集樣品中存在的所有糖肽。偏嗜法不僅可用于糖肽富集，還可以降低樣品的復(fù)雜性，缺點是會降低糖蛋白質(zhì)組的覆蓋率。盡管從理論上講，無偏嗜的方法可以富集/分離樣品中存在的所有糖肽，但是，具體選用哪種方法，需要從實驗設(shè)計出發(fā)。為了實現(xiàn)更全面的糖蛋白組覆蓋，建議將不同的糖肽富集方法結(jié)合使用。
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