蛋白A|Protein A 詳細介紹
在生物化學和分子生物學領域，Protein A作為一種重要的工具蛋白，在抗體純化、免疫沉淀等實驗中發(fā)揮著不可或缺的作用。本文將深入探討Protein A的來源、結(jié)構、功能、應用及其與其他相關蛋白（如Protein G和Protein A/G）的區(qū)別，旨在為讀者提供一個全面而深入的理解。
關鍵點
- 蛋白A是從金黃色葡萄球菌中提取的一個重要抗體結(jié)合蛋白，已在抗體純化中應用超過80年。
- 蛋白A具有較高的IgG結(jié)合親和力，主要通過與IgG的Fc區(qū)進行非共價相互作用。
- 研究表明，工程化的蛋白A可以在更溫和的條件下進行抗體純化，減少抗體的聚合。
- 由于穩(wěn)定性提升，工程化的蛋白A如Z域、C域等在不同pH環(huán)境下表現(xiàn)優(yōu)異，適合于高樣品負載的應用。
- 各種非特異性結(jié)合和雜質(zhì)去除的方法已被提出，以提高抗體純化的選擇性和效率。
- 納米顆粒（如磁性納米顆粒）作為新的支持材料已被成功應用于蛋白A的結(jié)合和抗體的純化。
- 蛋白A還有潛在的應用于生物傳感器，用于低濃度抗體的快速檢測。
由于抗體對病毒性疾病、癌癥、風濕病和其他神經(jīng)系統(tǒng)的治療作用，它們的產(chǎn)生和純化呈指數(shù)級增長。2019 年，美國食品藥品監(jiān)督管理局 （FDA） 批準了 PD-1 抗體和抗 EGFR mAb 等 90 種 mAb（單克隆抗體），而超過 50 種 mAb 仍處于臨床試驗階段。此外，在治療中，它可以直接附著以激活固體支持物，并用作檢測抗原的敲擊劑 。
抗體中的哪些功能會導致這些特性？免疫球蛋白，即 Igs，分子量約為 150 kDa，兩條重鏈有 450-650 個氨基酸和兩條輕鏈有 214 個氨基酸，斯托克斯半徑為 4 nm，等電點在 4.0-8.6 范圍內(nèi)。它們由四條多肽鏈組成。兩條相同的 50 kDa γ重鏈和兩條相同的 25 kDa k 或 λ 輕鏈，可產(chǎn)生約 150 KDa 的蛋白質(zhì)（IgG1、IgG2、IgG4 為 146 KDa，IgG3 為 170 KDa）。兩條重鏈通過二硫鍵在鉸鏈中連接：IgG1 和 IgG4 的兩個鍵，IgG2 的 4 個鍵和 IgG3 的 11 個鍵。此外，輕鏈的最后一個半胱氨酸殘基和重鏈的第五個半胱氨酸殘基產(chǎn)生二硫鍵帶?；谟?82-96% 蛋白質(zhì)和 4-18% 碳水化合物組成的糖蛋白，人體中的五類 Ig 是 IgM、IgD、IgG、IgA 和 IgE。根據(jù) IgG 的結(jié)構差異，將其分為四個亞類;IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4 在氨基酸水平上相同 90% 以上，而這些小于 10% 的差異（圖 1）對它們的功能和對各種類型抗原的反應起著重要作用。值得注意的是，幾乎所有已使用或未開發(fā)的抗體都使用 IgG1 亞類骨架。
圖 1.A） 四個亞類，B） IgG 及其片段的四肽鏈（重鏈;紅色和綠色，輕鏈;黃色）。
基于 Ig結(jié)構，Ig 分為兩條重鏈和兩條輕鏈。重鏈包括 N 末端可變結(jié)構域 （VH） 和三個恒定結(jié)構域 （CH1、CH2 和 CH3），而輕鏈由 N 末端結(jié)構域 （VL） 和一個恒定結(jié)構域 （CL） 組成。根據(jù)結(jié)合位點，Ig 分為兩部分;兩個片段抗原結(jié)合位點 （Fab） 區(qū)域和一個片段可結(jié)晶 （Fc） 區(qū)域（圖 1）。Fab 和 Fc 區(qū)通過二硫鍵連接在一起，稱為柔性鉸鏈區(qū)。Fab 作為高選擇性位點與抗原結(jié)合，而 Fc 區(qū)與許多不同的蛋白質(zhì)結(jié)合，例如含有新生兒 Fc 受體的細胞表面受體和細菌蛋白，如蛋白 A 和蛋白 G 。
IgG3 具有 11 個二硫鍵，而其他 IgG 亞類（IgG1、IgG2 和 IgG4）中只有 2-4 個二硫鍵。它導致 IgG3 有 13 種不同的多態(tài)性，稱為同種異型，而 IgG1、IgG2 和 IgG4 分別為 4、1 和 0 種同種異型。這種差異僅導致 IgG3 與蛋白 G 或蛋白 A/G 相互作用，而不與蛋白 A 相互作用。
到目前為止，一些已發(fā)表的綜述研究了用于 Ig 親和純化的不同種類的 Protein A，例如蛋白 A 模擬肽和工程蛋白，并比較了不同類型的市售 Protein A 基質(zhì)及其性質(zhì) .納米抗體較小的替代抗體形式，例如抗原結(jié)合片段 （Fab） 或帶有末端六組氨酸標簽的單鏈可變片段 （scFv），很容易通過固定化金屬親和色譜純化，但以前的研究表明 His 標簽對納米抗體生物分布有負面影響。
一、Protein A的來源與結(jié)構
Protein A是一種來源于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的表面蛋白，其分子量約為42KDa。作為微生物來源的天然蛋白質(zhì)，Protein A具有與哺乳動物的免疫球蛋白（尤其是IgG）特異性結(jié)合的能力。這一特性使得Protein A在抗體純化、免疫沉淀等生物技術領域具有廣泛的應用價值。普睿邁格提供高質(zhì)量重組蛋白A（http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/6945134937.html）。
圖2. A) 蛋白A基因組成包含信號序列（S）、五個IgG結(jié)合域（D、E、A、B和C）、細胞壁附著區(qū)域（XM），B) IgG Fc區(qū)的三個β轉(zhuǎn)角（灰色片段，上部蛋白）與蛋白A的B域的兩個α螺旋（紅色片段，下部蛋白）之間的相互作用。IgG 結(jié)合結(jié)構域：E、D、A、B 和 C（每個結(jié)構域 58 個氨基酸殘基）沉降在反平行的三個α螺旋中，所有結(jié)構域都顯示出與 IgG 的 Fc 區(qū)亞類（IgG1、IgG2 和 IgG4）的單獨相互作用，具有親和常數(shù)，KA 為 108 （?1），對 IgG3 的親和力非常弱。
Protein A由以下功能域組成：- 5個同源的IgG結(jié)合域（E、D、A、B、C），每個結(jié)構域均可結(jié)合IgG的Fc區(qū)域（Fahnestock et al., 1986）。
- 一個C端的細胞壁錨定結(jié)構域。
- 研究表明，其對不同物種和IgG亞類的結(jié)合效率存在差異，例如對人和兔IgG的結(jié)合能力較強，而對鼠、山羊等IgG的結(jié)合較弱（Hober et al., 2007）。
- 重組Protein A的優(yōu)化
- 為克服天然Protein A與部分IgG亞類結(jié)合的局限性并提高穩(wěn)定性，科研人員開發(fā)了重組Protein A（如rProtein A），通過引入點突變增強其耐堿性或改變親和力（Jansson et al., 1998）。這些改進降低了配體脫落風險，并延長了層析介質(zhì)壽命。
結(jié)構上，Protein A由多個IgG結(jié)合結(jié)構域組成，這些結(jié)構域能夠特異性地識別并結(jié)合IgG的Fc區(qū)段，而與Fab區(qū)或輕鏈的結(jié)合則相對較弱。此外，天然的Protein A還含有一些未知功能的非Fc結(jié)合域，這些區(qū)域在Protein A與雜蛋白的結(jié)合中可能發(fā)揮一定作用，從而影響純化后IgG的純度。
| 蛋白質(zhì) | 尺寸 （kDa） | 目標 | 洗脫 pH |
|---|---|---|---|
| 蛋白 A | 42 | FC、Fab | 3.5 |
| 蛋白 G | 30 | Fc、Fab、ScFv | 3.2 |
| 蛋白 L | 76–106 | Fab、ScFv、κ 輕鏈 | 2 |
| 蛋白質(zhì) Z | 6.7 | Fc | 3.6 |
| 蛋白質(zhì) LG | 50 | Fc、κ 輕鏈 | 2 |
| 蛋白 LA | 60 | Fc、κ 輕鏈 | 2 |
| 蛋白 AG | 47.3 | Fc | 3 |
CIP 是親和層析過程中的必要步驟，用于從純化設備中去除聚集的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等污染物。CIP 通常以一種簡單易行的方式使用濃度為 0.1 M 的氫氧化鈉 （NaOH） 作為最有效的清潔劑>去除緊密結(jié)合的變性和聚集物種，并滅活大多數(shù)微生物，如細菌、病毒和內(nèi)毒素 。雖然這種方法很容易使用并以低成本實現(xiàn)，但所有設備、蛋白質(zhì)和基質(zhì)都必須在高 pH 值下保持穩(wěn)定。為了提高蛋白 A 在堿 pH 值的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)工程取得了成功的結(jié)果，其中最著名的是對源自 B 結(jié)構域的 Z 結(jié)構域的研究 。
Nilsson 于 1987 年根據(jù)蛋白 A 的 B 結(jié)構域的第二個結(jié)構提出了 Z 結(jié)構域的第一個概念。根據(jù)這些文章，直接參與 Fc 區(qū)和蛋白 A 相互作用的氨基酸位于每個結(jié)構域的兩個螺旋上。盡管如此，研究證明，存在于結(jié)構域 E、D 和 A 中的蛋氨酸殘基會增加蛋白 A 的敏感性。此外，在 28-29 位存在天冬酰胺-甘氨酸 （Asn-Gly） 對高 pH 值敏感，并且在 CIP 惡劣條件下脫氨基。該反應是自發(fā)的、依賴于水的，并因氫氧根離子而加速。因此，缺乏 Asn-Gly 和降低水分含量是可取的。
1. 純化抗體
Protein A在抗體純化中的應用是其最為突出的功能之一。通過將Protein A偶聯(lián)于支持物（如瓊脂糖、磁珠等）上，可以構建一個高效的抗體純化系統(tǒng)。當含有抗體的生物樣品（如血清、腹水、細胞培養(yǎng)液等）流經(jīng)這個系統(tǒng)時，抗體中的Fc區(qū)段會與Protein A結(jié)合，從而實現(xiàn)抗體的分離和純化。瓊脂糖蛋白A磁珠請參考（http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/0293713052.html）
值得注意的是，由于Protein A與IgG的結(jié)合具有高度的特異性，因此這種方法能夠高效地去除樣品中的其他雜質(zhì)，如血清白蛋白、細胞碎片等，從而得到高純度的抗體。此外，通過調(diào)整偶聯(lián)條件、洗脫條件等參數(shù)，還可以進一步優(yōu)化純化效果，滿足不同實驗需求。
2. 免疫沉淀
除了純化抗體外，Protein A還常用于免疫沉淀實驗中。免疫沉淀是一種利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理，從復雜蛋白混合物中分離出特定蛋白的方法。在實驗中，首先將特異性抗體與目標蛋白結(jié)合形成抗原-抗體復合物，然后利用Protein A與IgG的結(jié)合能力，將抗原-抗體復合物吸附到Protein A偶聯(lián)的支持物上。最后，通過洗脫等步驟，可以得到純化的目標蛋白。
免疫沉淀技術不僅可以用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，還可以用于研究蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、定位等生物學特性。此外，結(jié)合質(zhì)譜等高通量分析技術，免疫沉淀還可以用于蛋白質(zhì)組學研究，為揭示細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡提供有力工具。
3. 去除或減少非特異性背景
在免疫沉淀等實驗中，非特異性背景的存在往往會影響實驗結(jié)果的準確性和可靠性。為了降低非特異性背景，可以在實驗中加入Protein A/G Beads等試劑。這些試劑能夠吸附樣品中的非特異性蛋白和雜質(zhì)，從而降低背景干擾。同時，由于Protein A/G具有更廣泛的抗體結(jié)合能力，因此還可以用于純化那些不能與Protein A單獨結(jié)合的抗體。
三、Protein A與其他相關蛋白的區(qū)別
在抗體純化與免疫沉淀領域，除了Protein A外，還有Protein G和Protein A/G等蛋白也常被用于這些實驗中。為了更全面地理解Protein A的作用和優(yōu)勢，我們需要將其與其他相關蛋白進行比較和分析。
1. Protein G
除了蛋白 A，還有一些關于蛋白 G 的研究，它對 IgG（所有亞型）和人血清白蛋白都有親和力。蛋白 G 的 C 端包含三個均相 IgG 結(jié)合結(jié)構域，具有一個中央 α 螺旋和三個分子量為 11.5 kDa 的 β 折疊 。Protein G是一種來源于鏈球菌G族的細胞表面蛋白，也是III型Fc受體的一種。與Protein A類似，Protein G也具有與IgG特異性結(jié)合的能力。然而，與Protein A不同的是，Protein G不僅能夠結(jié)合IgG的Fc區(qū)段，還能夠結(jié)合Fab區(qū)段。這使得Protein G能夠更廣泛地結(jié)合多種類型的IgG分子，包括那些不能與Protein A結(jié)合的IgG。重組蛋白G購買請參考（http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/6093125842.html）
此外，Protein G還具有較低的血清蛋白結(jié)合水平，因此純化得到的產(chǎn)物純度較高。同時，由于Protein G的配基脫落率較低，因此在使用過程中能夠保持較高的穩(wěn)定性和可靠性。然而，需要注意的是，Protein G對某些特定種屬的抗體（如兔抗體）的親和力可能較低，因此在選擇使用時需要根據(jù)實驗需求進行權衡。
2. Protein A/G
當然，由于它與白蛋白的非特異性相互作用，已經(jīng)對結(jié)構修飾進行了一些嘗試，例如僅使用 IgG 結(jié)合結(jié)構域作為配體或它們與蛋白 A 結(jié)構域的偶聯(lián)。Dong 及其同事成功地設計了蛋白 A 的 D 結(jié)構域與蛋白 G 的 C1 結(jié)構域的結(jié)合，其結(jié)合常數(shù)值分別比蛋白 G 和蛋白 A 高 12 倍和 8.4 倍。Protein A/G是一種兼具Protein A和Protein G特點的融合蛋白。它結(jié)合了Protein A和Protein G的結(jié)合位點，因此具有更廣泛的抗體結(jié)合能力和更高的特異性。這使得Protein A/G在純化抗體和降低非特異性背景方面表現(xiàn)出更優(yōu)異的性能。
此外，由于Protein A/G具有更大的特異性表面區(qū)域和更多的表面抗體結(jié)合位點，因此在使用過程中能夠減少非特異性結(jié)合的發(fā)生。這使得Protein A/G在免疫沉淀等實驗中具有更高的靈敏度和準確性。然而，需要注意的是，由于Protein A/G結(jié)合了兩種蛋白的特點，因此其制備成本可能相對較高。
四、Protein A的應用案例與注意事項
1. 應用案例
在實際應用中，Protein A已被廣泛應用于各種抗體純化、免疫沉淀等實驗中。例如，在制備單克隆抗體時，可以利用Protein A偶聯(lián)的磁珠從細胞培養(yǎng)液中快速分離和純化抗體；在研究蛋白質(zhì)相互作用時，可以利用Protein A進行免疫共沉淀實驗，從而揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡；在疾病診斷和治療中，可以利用Protein A純化的抗體進行免疫組化、流式細胞術等檢測手段，為疾病的診斷和治療提供有力支持。
2. 注意事項
在使用Protein A進行抗體純化或免疫沉淀實驗時，需要注意以下幾點：
- 選擇合適的偶聯(lián)條件：不同的偶聯(lián)條件會影響Protein A與抗體的結(jié)合效率和穩(wěn)定性。因此，在選擇偶聯(lián)條件時需要根據(jù)實驗需求進行優(yōu)化。
- 控制洗脫條件：洗脫條件是影響純化效果的關鍵因素之一。通過調(diào)整洗脫液的pH值、離子強度等參數(shù)，可以優(yōu)化洗脫效果，提高抗體的純度和回收率。
- 避免非特異性結(jié)合：非特異性結(jié)合是影響實驗結(jié)果準確性的重要因素之一。為了減少非特異性結(jié)合的發(fā)生，可以在實驗中加入適量的抑制劑或進行預清除處理。
- 注意實驗安全：由于Protein A來源于金黃色葡萄球菌等微生物，因此在實驗過程中需要注意無菌操作和安全防護，避免實驗污染和交叉感染的發(fā)生。
Protein A作為一種重要的工具蛋白，在抗體純化、免疫沉淀等生物技術領域具有廣泛的應用價值。通過深入了解Protein A的來源、結(jié)構、功能及其與其他相關蛋白的區(qū)別，我們可以更好地利用這一工具蛋白進行科學研究和技術開發(fā)。
未來，隨著生物技術的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，Protein A的應用領域?qū)訌V泛和深入。例如，在抗體藥物研發(fā)中，可以利用Protein A進行高效、快速的抗體篩選和純化；在蛋白質(zhì)組學研究中，可以利用Protein A進行高通量的蛋白質(zhì)分離和鑒定；在疾病診斷和治療中，可以利用Protein A純化的抗體進行更加精準和有效的檢測和治療手段。
總之，Protein A作為一種重要的生物技術工具，將在未來的科學研究和技術創(chuàng)新中發(fā)揮更加重要的作用。我們相信，在不久的將來，Protein A將會為生物科學領域的發(fā)展帶來更多的驚喜和突破。
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