磁珠法GST pull down實(shí)驗(yàn)原理及操作
一、GST pull-down 基本知識(shí)
1. GST pull-down 概念
GST pull-down：是利用重組技術(shù)將探針蛋白與 GST 谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合，融合蛋白通過 GST 與固相化在球珠上的 GSH 谷胱甘肽結(jié)合。從而分離出能與融合蛋白相互作用的蛋白的技術(shù)。
2. GST pull-down 研究對(duì)象
二、GST pull-down 原理
1. GST pull-down 結(jié)合原理
構(gòu)建GST標(biāo)簽融合表達(dá)的蛋白，然后用谷胱甘肽磁珠結(jié)合GST融合蛋白。
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2. GST pull-down 分離原理
如果是采用磁珠的話，可以采用磁分離磁珠，而無需采用離心的方法。
三、GST pull-down 流程
1. 蛋白的抽提與純化：
① 原核表達(dá)蛋白純化
② 真核表達(dá)蛋白抽提
2. 體系孵育與 pull-down
3. 考染檢測(cè)與 WB 驗(yàn)證
四、GST pull-down 結(jié)果
1. GST pull-down 結(jié)果分析
① 考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)
② Western blot 驗(yàn)證
五、GST pull-down 拓展
1. GST pull-down 與 Co-IP 區(qū)別
① GST pull-down
② Co-IP
GST pull-down 與 Co-IP 區(qū)別：
GST pull-down 是原核純化蛋白與真核蛋白在試管內(nèi)發(fā)生生化反應(yīng)互作的結(jié)果，只要互作蛋白間具有相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)即可實(shí)驗(yàn)證明；
Co-IP 實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)目的蛋白，并通過 IgG 球珠-抗體-蛋白復(fù)合物體系，分離出互作的蛋白復(fù)合物，是細(xì)胞內(nèi)的體內(nèi)反應(yīng)結(jié)合。
2. GST pull-down 實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)
① 可驗(yàn)證蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的直接互作。
② GSH 谷胱甘肽偶聯(lián)球珠親和力強(qiáng)，洗脫純度高。
3. GST pull-down 實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn)
① 驗(yàn)證互作是在試管中進(jìn)行的生化反應(yīng)，不能夠完全反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白真實(shí)互作狀態(tài)。
② 融合表達(dá)的 GST 標(biāo)簽，肽鏈較長(zhǎng)，可能會(huì)改變?cè)康牡鞍椎脑械恼郫B結(jié)構(gòu)。
GST蛋白pull down磁珠請(qǐng)參考如下網(wǎng)頁：
200nmGSH磁珠 http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/2897354213.html
20-45um 瓊脂糖GSH磁珠 http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/3249714524.html
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