一文讀懂 DNA pull-down 技術(shù)
在前面的文章中我們和大家一起學(xué)習(xí)了RNA pull-down這種實驗技術(shù)，好學(xué)且好奇心強的小編又很快發(fā)現(xiàn)一種和它挺像的叫做DNA pull-down的新技術(shù)，再一起來看看吧。
一、原理概述
DNA pull-down是體外研究DNA與蛋白互作的有力工具。體外制備生物素標記的靶DNA系列，使其與待測蛋白液孵育，形成“生物素化DNA-蛋白質(zhì)”復(fù)合物。由于生物素與鏈霉親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用之間，因此采用鏈霉親和素磁珠將靶DNA及其結(jié)合蛋白從待測蛋白液中分離出來。通過western blot實驗檢測洗脫液中是否有待測蛋白，通過LC-MS/MS技術(shù)檢測靶DNA的潛在結(jié)合蛋白（如具體某個或某些轉(zhuǎn)錄因子/組蛋白等）。
二、實驗流程
一般來說，該實驗首先，需要針對待研究目的基因的調(diào)控區(qū)域設(shè)計并制備特異性探針（以脫硫生物素標記為主流）；同時，制備細胞核提取物；將探針和核提取物共同孵育，DNA結(jié)合蛋白就會和靶向序列特異性結(jié)合；然后，通過親和素磁珠純化蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物；最后針對獲得的蛋白，使用western blot驗證或者質(zhì)譜方式鑒定蛋白質(zhì)類型。
優(yōu)點：
① 富集分析低豐度蛋白；
② 探針制備簡便，周期短；
③ 獲得特異性蛋白與下游蛋白質(zhì)檢測技術(shù)兼容；
缺點：
① 長連探針往往存在非特異結(jié)合現(xiàn)象；
② 反應(yīng)條件要求無核酸酶；
③ 體外實驗，相對體內(nèi)實驗存在一定弊端；
以下為參考實驗流程，不同實驗室會有細微差異：
1．探針設(shè)計及標記
（1）采用基因組DNA做模板，經(jīng)PCR擴增啟動子片段；
（2）將其克隆至克隆載體，并測序鑒定成功；
（3）使用PCR法或末端標記法標記探針；
（4）標記的探針利用凝膠回收試劑盒純化回收探針，并檢測探針濃度；
（5） -20℃保存，待用；
2．Pull down
（1） 預(yù)先混合 5μg 生物素標記的 DNA 和 500μg 核蛋白，置于冰上；
（2） 取 100μl 鏈霉親和素磁珠（PuriMag G-strep），用冰冷 PBS 洗一次，5000g 離心 30 秒；
（3） 將 DNA 與蛋白的混合物加到磁珠中，重懸磁珠；
（4） 4℃孵育 1 小時；
（5） 5000g，離心 30 秒，去除上清，收集沉淀；
（6） 用冰冷 PBS 洗磁珠三次，5000g 離心 1 分鐘，盡可能去除上清，收集沉淀；
（7） 加入 30μl 蛋白上樣緩沖液，重懸沉淀，沸水煮 10 分鐘，
3．蛋白質(zhì)檢測-- western blot
（1） 電泳：實驗采用不連續(xù)系統(tǒng)蛋白質(zhì)SDS-PAGE，濃度為5%濃縮膠和8~12%濃度分離膠；每孔上樣40~60ug總蛋白，開始電壓為100v,到達分離膠后調(diào)為120v；
（2） 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜為恒流轉(zhuǎn)膜，電流為200mA，時間根據(jù)目的蛋白分子量選擇60~120min。
（3） 封閉：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液；加入5%脫脂奶粉封閉液，室溫50rpm，封閉60分鐘。
（4） 孵育一抗：根據(jù)蛋白Marker指示將PVDF膜剪開，參考一抗?jié)舛龋粚VDF膜分別放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗過夜，然后放入TBST洗滌液，搖動洗滌3次，每次15min。
（5） 孵育二抗：參考二抗?jié)舛?，按比例稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。將PVDF膜加入稀釋好的二抗，室溫搖動孵育1h；放入TBST洗滌液，搖動洗滌3次，每次15min。
（6） 顯色：使用化學(xué)發(fā)光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液及定影液洗片。
4．蛋白質(zhì)檢測-- MS
（1） 切膠：用刀片切取膠粒（膠粒直徑1-2mm），置于1.5ml EP管中。
（2） 清洗：用200ul MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘。
（3） 脫色：對于考染膠，加考染膠色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200ul，37℃ 20分鐘或超聲脫色5分鐘，吸干，重復(fù)脫色2-3次，至藍色褪去。
（4） 脫水：加ACN 100ul脫水至膠粒變白，吸棄ACN。
（5） 清洗：用200ul MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘；然后用200ul 50% ACN震蕩清洗2次，每次10分鐘。
（6） 脫水：加ACN 100ul 脫水至膠粒變白，吸棄ACN。
（7） 用25mM NH4HCO3稀釋Trypsin 至12.5mg/ml，每管加10ul，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4℃放置30min ，待酶液被膠粒完全吸收，吸棄多余的酶液，加25mM NH4HCO3 20ul，37℃過夜(16h)。
（8） 質(zhì)譜樣品使用德國Bruker公司的Ultraflex III質(zhì)譜儀開展分析，參數(shù)設(shè)置：反射模式；
（9） 離子源加速電壓1為24kv；
（10） 加速電壓2為22kv；
（11） 離子延遲提取0.000ns；
（12） 真空度1.4×10-7 Torr；
（13） 質(zhì)譜信號單次掃描累加200次；
（14） 使用標準Maker峰作為外標校正質(zhì)譜峰，正離子譜測定，測定范圍控制在700-4000；
（15） 樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜，胰酶自降解峰和污染物質(zhì)的峰自動剔除；
（16） 利用LIFT軟件將PMF強度最大的5個峰進行串級質(zhì)譜分析（峰強度大于300）。
DNA-pull dwon模式圖如下所示：
三、結(jié)果示意圖：
額，好像跟RNA pull-down確實很像，就是RNA換成了DNA，檢測的對象就變成了DNA與蛋白的互做。那么它有哪些應(yīng)用呢？
四．技術(shù)應(yīng)用
核酸與蛋白質(zhì)的互作是細胞功能的核心，包括蛋白質(zhì)合成、mRNA組裝等生命活動中重要的代謝過程，研究核酸與蛋白質(zhì)的互作是研究生命科學(xué)的基本工具。DNA pull-down主要用于目的DNA片段的互作蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子等）篩選。
五、DNA pull down常見疑點解析
Q：1. 適配子DNA單鏈，可以用帶有互補鏈的磁珠進行pull down嗎？如果可以，效率怎么樣？一般需要怎么優(yōu)化條件？
A：理論上說,若DNA單鏈能夠與磁珠上的互補鏈雜交成功,是可以進行pull down實驗的; 效率如何不好確定,這個取決于兩條DNA單鏈是否能雜交成功、蛋白-DNA結(jié)合的強弱、蛋白的豐度等。
Q2： DNA pull down的 原理？
A：針對目標區(qū)域設(shè)計特異性DNA探針并進行生物素標記，生物素探針可與偶聯(lián)在磁珠上的鏈霉親和素結(jié)合；細胞蛋白提取物與磁珠-DNA探針孵育，從而釣取與DNA探針有特異性結(jié)合的互作蛋白質(zhì)。
Q3： 你們對外服務(wù)的檢測項目有哪些？
A：細胞、動物/植物組織、菌體都可以做DNA pull down, 我們還可以做的檢測實驗具體如下:
(1) RNA-蛋白/RNA互作及定位：RNA pull down、RIP、fish等;
(2) DNA-蛋白互作：DNA pull down、ChIP、EMSA、雙熒光素酶、酵母單雜等;
(3) 蛋白-蛋白互作：GST/his pull down、CoIP、酵母雙雜等;
(4) 細胞學(xué)檢測：細胞增殖-MTT/CCK-8, 細胞凋亡, 細胞周期,細胞遷移、侵襲：劃痕愈合/Transwell/Transwell（Matrigel）等;
(5) 外泌體服務(wù)：提取、鑒定(Nanosight粒徑檢測/電鏡/WB)、測序(miRNA/lncRNA)、蛋白質(zhì)組學(xué);
(6) 轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組：真核有參轉(zhuǎn)錄組、無參轉(zhuǎn)錄組、真核lncRNA、small RNA等。
Q4：效率有多高？
A：效率主要取決于蛋白-DNA結(jié)合的強弱、蛋白的豐度等。
Q5：老師，對照組的DNA序列是怎么選擇的？
A：一般對照組是沒有探針的,對照組是磁珠beads+蛋白。
Q6：DNA pull down有什么缺陷嗎？
A：DNA pull down-MS是體外研究蛋白-DNA是否有直接互作的經(jīng)典技術(shù)，是將探針結(jié)合在凝膠/磁珠上，釣取與DNA探針有互作的蛋白；就技術(shù)而言,沒有明顯的缺陷;后續(xù)質(zhì)譜能鑒定到多少蛋白取決于蛋白-DNA結(jié)合的強弱、蛋白的豐度等。
Q7： 做DNA pulldown 用DNA單鏈好還是雙鏈好？
A：常規(guī)的是用DNA雙鏈作為探針。
Q8： 可以簡單講一下生物素標記引物的原理嗎？
A：主要利用生物素（biotin）和親和素（avidin）這兩種分子的獨特性質(zhì); 親和素的每個亞基都能結(jié)合一個生物素分子,兩者的結(jié)合是通過生物素的脲基環(huán)部分完成的;因此可將其戊酸側(cè)鏈通過酰胺鍵與核酸分子相連，構(gòu)成生物素標記的核酸探針。
Q9： 如果做轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子和DNA結(jié)合發(fā)起轉(zhuǎn)錄，不應(yīng)是和打開的單鏈結(jié)合嗎?
A：啟動子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點（結(jié)構(gòu)基因）5'端上游的DNA序列，就像"開關(guān)"，決定基因的活動，本身并不控制基因活動，而是通過與特定蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合而控制基因的活動。轉(zhuǎn)錄因子就像一面"旗子"，指揮著酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases) 的活動，這種酶制造著基因的RNA復(fù)制本。轉(zhuǎn)錄因子是與啟動子DNA雙鏈結(jié)合的。
Q10：做100bp突變對照組應(yīng)該怎么突變堿基？
A：可以通過查找相關(guān)資料確定啟動子發(fā)揮功能的核心區(qū)域,將核心區(qū)域進行突變;一般是A/G互換,C/T互換突變。
Q11： DNA互補鏈可以相互釣取嗎？
A：DNA pull down 是研究蛋白-DNA的互作,不可以用DNA互補鏈相互釣取。
Q12：請問DNA為什么會與蛋白質(zhì)互作呢，它們有什么功能的聯(lián)系嗎？
A：DNA pulldown 是研究蛋白-DNA的互作, 主要應(yīng)用于尋找已知的啟動子序列所結(jié)合的未知蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）；啟動子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點（結(jié)構(gòu)基因）5'端上游的DNA序列，就像"開關(guān)"，決定基因的活動，本身并不控制基因活動，而是通過與特定蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合而控制基因的活動。
Q13： 如果做小肽對細菌的作用是否也可以DNA pull down？
A：小肽屬于蛋白類, 做不了DNA pull down。
Q14：未加探針的對照組鑒定出蛋白是什么原因呢？
A：對照組是磁珠beads+蛋白，雖然沒有探針，但少量蛋白可以與磁珠相結(jié)合，對照組鑒定到的蛋白是非特異性的背景蛋白。
用于pull-down的鏈霉親和素磁珠請參考:
http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/8271042221.html (200nm鏈霉親和素磁珠)
http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/9728163513.html (1um鏈霉親和素磁珠)
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