修飾引物的常見方法、類型及應(yīng)用
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修飾類型 |
修飾名稱 |
特點(diǎn)及應(yīng)用 |
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反義DNA合成 |
硫代 |
硫代修飾(Phosphorthioate)的寡核苷酸主要用于反義實(shí)驗(yàn)中防止被核酸酶降解。您可以選擇全硫代，但隨著硫代堿基的增加，寡核苷酸的Tm值會(huì)降低，為了降低這種這種影響，可以對(duì)引物兩端2-5個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾，通?？梢赃x擇5'和3'各3個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾。 |
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2氟代核糖核酸 |
A和G因?yàn)槠浔容^復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)而難于合成，一般常用的2氟代的有C和U. |
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2'-O-甲基核糖核酸 |
在RNA的修飾中， 2'-O-甲基核糖核酸(2'-O-甲基-RNA)修飾普遍存在于tRNA 和其他轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的小RNA中，含有2'-O-甲基核糖核酸寡核苷酸片段可以被直接合成，這個(gè)修飾可以增加RNA：RNA duplexes的Tm值，但是對(duì)于RNA:DNA的穩(wěn)定性將會(huì)有微小的改變，如果期待以單鏈核酸的形式被進(jìn)攻，他是穩(wěn)定的，并且是典型的5-10個(gè)折疊，比DNA更不易與DNases相結(jié)合，作為能夠穩(wěn)定增加與目標(biāo)信息結(jié)合能力的有效工具，2'-O-甲基核糖核酸修飾被普遍應(yīng)用于反義寡核苷酸。 |
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5-甲基脫氧胞嘧啶 |
每個(gè)脫氧胞嘧啶被5-甲基脫氧胞嘧啶(5-Methyl Dc)取代后其熔點(diǎn)溫度將會(huì)增加0.5℃，另外當(dāng)寡核苷酸片段植入活體內(nèi)引發(fā)一些不必要的免疫反應(yīng)，5-甲基脫氧胞嘧啶在CpG 修飾中的出現(xiàn)將會(huì)阻止或限制這些反應(yīng)，這一點(diǎn)在反義核酸應(yīng)用中是非常重要的一方面。 |
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堿基修飾 |
脫氧次黃嘌呤 |
脫氧次黃嘌呤(deoxyInosine，dI)是一個(gè)自然存在的堿基，雖然不是真正意義上的通用堿基，但當(dāng)與其它堿基結(jié)合時(shí)，會(huì)比其它堿基錯(cuò)配相對(duì)更穩(wěn)定。脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結(jié)合能力為dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT。在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃嘌呤首選與dC結(jié)合。 |
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脫氧脲嘧啶 |
脫氧脲嘧啶(DeoxyUridine，dU)可以插進(jìn)寡核苷酸來增加雙鏈的熔點(diǎn)溫度從而增長(zhǎng)雙鏈的穩(wěn)定性。每個(gè)脫氧胸腺嘧啶被脫氧脲嘧啶替代可以增長(zhǎng)雙鏈熔點(diǎn)溫度1.7℃。 |
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2-氨基嘌呤 |
2-氨基嘌呤(2-Aminopurine)在寡核苷酸中可以替代 dA，它是一種常見的熒光分子，對(duì)于周圍環(huán)境較敏感， 可作為一種有效的探針用于監(jiān)測(cè)DNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的構(gòu)成和動(dòng)態(tài)變化，還可以檢測(cè)雙螺旋堿基的堆積狀態(tài)，2-氨基嘌呤會(huì)不確定地輕微地降低Tm值。 |
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5-溴-脫氧尿嘧啶 |
5-溴- 脫氧尿嘧啶(5-Bromo dU) 是一種光敏的鹵代堿基，在有紫外線照射的情況下，它可被摻入寡核苷酸里與DNA，RNA 或蛋白交聯(lián)，在308 nm處時(shí)，交聯(lián)效率最大。 |
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反向dT |
反向dT (Inverted dT)可以被合成在寡核苷酸的-末端，從而形成交聯(lián)，形成的交聯(lián)可以抑制在DNA聚合酶延伸過程中的外切核酸酶的降解作用。 |
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雙脫氧胞苷 |
雙脫氧胞苷(3'ddC Dideoxy-C)是連接在末端阻止DNA聚合酶在端的延伸。 |
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間臂 |
間臂(Spacer)可為寡核苷酸標(biāo)記提供必要的間隔以減少標(biāo)記基團(tuán)與寡核苷酸間的相互作用，主要應(yīng)用于DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)和雙鏈結(jié)構(gòu)研究。C3 spacer 主要用于模仿核糖的和羥基間的三碳間隔，或“替代”一個(gè)序列中未知的堿基。-Spacer C3用于引進(jìn)一個(gè)間臂從而阻止端外切酶和端聚合酶發(fā)揮作用。Spacer 18 常用于引進(jìn)一個(gè)強(qiáng)疏水基團(tuán)。 |
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氨基修飾 |
內(nèi)部氨基修飾 |
主要用C6-dT aminolinker來加到胸腺嘧啶殘基上來進(jìn)行內(nèi)部修飾。修飾后氨基與主鏈相距10個(gè)原子距離，可用于進(jìn)一步的標(biāo)記和酶連接(如堿性磷酸酶)，目前提供內(nèi)部氨基修飾介導(dǎo)的dT-Dabcyl、dT-Biotin和dT-Digoxingenin 修飾。 |
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5'氨基修飾 |
可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應(yīng)用在DNA芯片(DNA Microarray)和多重標(biāo)記診斷系統(tǒng)。目前提供5’ C6 氨基修飾和5’C12氨基修飾兩種，前者可用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會(huì)影響其功能的化合物，后者用于親和純化基團(tuán)的連接和一些熒光標(biāo)記，尤其是當(dāng)熒光可能會(huì)因標(biāo)記太靠近DNA鏈而被淬滅時(shí)。 |
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3'氨基修飾 |
目前提供C6 氨基修飾。它可用于設(shè)計(jì)新的診斷探針和反義核苷酸，例如5’端可用高度敏感的32P或熒光素標(biāo)記的同時(shí)3'可用氨基修飾以進(jìn)行其他的連接。此外，修飾可以抑制外切酶酶解，從而可用于反義實(shí)驗(yàn)。 |
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巰基修飾 |
5’-巰基(Thiol)在很多方面與氨基修飾類似。巰基可用于加附各種修飾如熒光標(biāo)記物和生物素。例如可以在碘乙酸和馬來酰亞胺衍生物存在下來制作巰基連接的熒光探針。5’的巰基修飾主要用5’巰基修飾單體(5’-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite)。用5’-Thiol-Modifier C6-CE單體修飾后必須進(jìn)行硝酸銀氧化以去除保護(hù)基(trityl)，而Thiol-Modifier C6 S-S CE單體修飾后須用DTT將二硫鍵還原成巰基。 |
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磷酸化 |
5’磷酸化(Phosphorylation)可用于接頭、克隆和基因構(gòu)建以及連接酶催化的連接反應(yīng)。磷酸化可抗外切酶消化的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸反應(yīng)。 |
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地高辛 |
地高辛(Digoxigenin)是一種從毛地黃植物分離出來的類固醇物質(zhì)，因?yàn)槊攸S植物的花和葉子是這種物質(zhì)唯一自然來源，所以抗地高辛抗體不會(huì)結(jié)合到其他生物物質(zhì)。地高辛經(jīng)由一個(gè)11個(gè)原子的間臂連接到脲嘧啶的C5位置。雜交的地高辛探針可以由抗地高辛抗體來檢測(cè)，這個(gè)抗體一般會(huì)與堿性磷酸酶，過氧化物酶，熒光素或膠體金偶連?；蛘邲]有偶連的抗地高辛抗體但偶連的抗體。地高辛標(biāo)記的探針可用于各種雜交反應(yīng)，如DNA-DNA雜交(Southern blotting)，DNA-RNA雜交(Northern blotting)斑點(diǎn)雜交(Dot blotting )，克隆雜交，原位雜交以及酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。 |
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生物素 |
生物素(Biotin)修飾的寡核苷酸能緊緊的結(jié)合在鏈霉親和素蛋白上，鏈霉親和素蛋白可以標(biāo)記上熒光染料和酶或是附著的中間結(jié)合物附著在固體物生物表面，不同的分子生物學(xué)和純化方法都包含生物素修飾。生物素修飾可以利用C6或是TEG間臂被添加在寡核苷酸的5’ 或 末端，生物素TEG需要純化，中間的生物素修飾可以通過dT堿基加入，這種形式需要更多的純化步驟。引物生物素標(biāo)記，可用于非放射性免疫分析來檢測(cè)蛋白質(zhì)、胞內(nèi)化學(xué)染色、細(xì)胞分離、核酸分離、雜交檢測(cè)特異性的DNA/RNA序列、離子通道構(gòu)象變化等。 |
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