核酸提取方法的深度解讀 提取操作關(guān)鍵點解讀
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一、核酸
核苷酸單體聚合而成的生物大分子，是生物細胞最基本和最重要的成分。一般認為，生物進化即始于核酸，因為在所有生命物質(zhì)中只有核酸能夠自我復制。今天已知核酸是生物遺傳信息的貯藏所和傳遞者。一種生物的藍圖就編碼在其核酸分子中。核酸是1869年米歇爾(F. Miescher)在膿液的白細胞中發(fā)現(xiàn)的。他當時稱之為核素。阿爾特曼(R. Altmann)于1889年認識其酸性后，定名為核酸。
二、核酸的分類和功能
核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。這兩類核酸有某些共同的結(jié)構(gòu)特點，但生物功能不同。
DNA貯存遺傳信息，在細胞分裂過程中復制，使每個子細胞接受與母細胞結(jié)構(gòu)和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白質(zhì)合成中起作用，負責將DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)變成特定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
核酸的基本結(jié)構(gòu)單元是核苷酸，核苷酸含有含氮堿基、戊糖和磷酸3種組分。堿基與戊糖構(gòu)成核苷，核苷的磷酸酯為核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脫氧核糖(核糖中2位碳原子上的羥基為氫所取代)。核酸就是根據(jù)其中戊糖種類來分類的，DNA和RNA的堿基也有所不同。
三、核酸的理化性質(zhì)
RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L，DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA 時，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細胞中的糖，RNA 及無機離子等，從中分離DNA。
四、細胞裂解
（一）裂解原理在核酸提取過程中，細胞裂解是非常重要的。
經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞 (如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl) 等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。
（二）細胞的裂解方法
細菌細胞破碎方法有以下幾種：
1）機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法。關(guān)于超聲波處理法，要設定好超聲時間和間隙時間，一般超聲時間不超過5秒，間隙時間最好大于超聲時間。
2）化學試劑法：用含SDS或CTAB的溶液處理細胞，在一定的pH環(huán)境和變性條件下,細胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相，pH環(huán)境則由加入的強堿(NaOH)或緩沖液( TE、STE等)提供，表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA等)可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護核酸不被降解。
3）反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。個人經(jīng)驗一般情況，37℃,3min，液氮3min,反復三次即可以。
4）酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶、蛋白酶K等，都可使細胞壁破碎，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),促進核酸的分離。其中溶菌酶能催化細菌細胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時仍保留酶活性,這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用、機械作用、化學作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實驗目的來確定。
（三）裂解方法的評價
含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組 DNA 的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進作用；同時，巨大的基因組DNA 是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組 DNA “纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組 DNA 的純度更高。另外一個思路是，如果基因組 DNA 與蛋白質(zhì) “纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優(yōu)勢，則純化時以 DNA 的形式被保留下來，導致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時以蛋白質(zhì)的形式被去除，導致 DNA 的損失。當然去污劑裂解方法，仍然在細胞基因組 DNA 抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡?，而?jīng)濟性及操作簡單很重要時?？刂坪昧呀庖?樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實現(xiàn)最簡單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會比用PC抽提的差一些。
高濃度蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，是抽提 RNA 的首選?？?RNA 的抽提，最重要的是快速裂解細胞膜，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì) “纏”住的問題，因為都不會對以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細胞膜，進而迅速抑制住細胞內(nèi)的 RNA 酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA 的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎的。當然有些樣品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也強烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)) ，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎。
含 CTAB 的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關(guān)：一是CTAB 的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質(zhì)量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因為即使是同一公司生產(chǎn)的純度一樣的 CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時，CTAB 的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時的溫度，多使用 65℃；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴重或者得率太低，可以試一下 37℃ – 45℃這個相對低溫的區(qū)域。
SDS 堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA 污染的特點。控制好裂解液/菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在4℃會更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4℃靜置一段時間以及采用 4℃離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用 PC 純化，但結(jié)合 PC 純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 來實現(xiàn)?？偟母杏X是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對大質(zhì)粒 (50 kb 以上)，該方法可能會有問題。
PCR 模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。也正因為不純化，所以，假陰性 (即沒有擴增出來的陽性) 比例也比較高。該方法最簡單的就是反復凍融法，簡便快捷，不需任何化學試劑，凍融離心，PCR檢測就可以了。如果使用裂解法，最簡單的裂解液就是水，復雜一點的就會含有一些不會抑制后續(xù)的 PCR 反應，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制 PCR 反應雜質(zhì)的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復雜一點的就會含有諸如 Chelex 100 之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡單，多使用溫度的變化來實現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因為樣品量的降低，同時意味著 PCR 的抑制物量的降低。
裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復雜且不徹底，導致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準的，而不是以核酸含量為基準，這一點務必牢記。
五、核酸純化
就個人所知，目前在科研領域廣泛使用的核酸純化技術(shù)主要可以分為兩大類：使用介質(zhì)的和不使用介質(zhì)的，使用介質(zhì)的，一次就將核酸與其它所有雜質(zhì)分開；不使用介質(zhì)的，一定是首先將核酸和鹽與大分子雜質(zhì)分開，再通過沉淀核酸使核酸與鹽分開 (PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。
1）經(jīng)典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)：細胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1 體積) 混合液。依據(jù)應用目的，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機相，核酸則被留于上層水相。酚是一種有機溶劑，預先要用STE 緩沖液飽和，因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)；故在制備酚飽和液時要加入一特殊物質(zhì)，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可被一些有機溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5.5 ，終濃度為0.3M的NaAc 或KAc 后，鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷，在酸性環(huán)境中促進核酸的疏水復性。然后加入2～2. 5 倍體積的乙醇,經(jīng)一定時間的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機溶劑（異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等）和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨、8. 0mol/ L 的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀。
2）使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被聯(lián)結(jié)在離子交換介質(zhì)上；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用高鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來。再經(jīng)過標準的乙醇/異丙醇沉淀、乙醇洗滌、干燥等操作，獲得純的核酸，溶解于合適的緩沖液中。
3）使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被吸附介質(zhì)選擇性吸附；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用水或者合適的低鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來，就可以直接用于后續(xù)實驗。
4) 密度梯度離心法：密度梯度離心也用于核酸的分離和分析。雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA 和蛋白質(zhì)具有不同的密度，因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法適用于大量核酸樣本的制備，其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認為是純化大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標準介質(zhì),梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射，產(chǎn)生熒光而被檢測，用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。
（二）純化方法評價
PC(P是英文酚的縮寫，C是英文氯仿的縮寫)抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次 PC 抽提都會損失一部分核酸 (因為不可能將水相全部移取)，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。PC 抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會強烈到 DNA 變成 10kb 以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會大于 20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對 PCR 和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻 – 此時的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因為苯酚去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組 DNA 會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4℃離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特點，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用 PC 抽提的，否則核酸必定降解。
高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4℃ 會更好一些。
介質(zhì)純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其最大特點是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因為受人為操作因素影響小，純度的穩(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。其致命弱點是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀 (如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因為加入的液體通過離心后會進入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。
（三）醇的沉淀
1）沉淀的原理目的：目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–主要是鹽的分離。就核酸而言，標準的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當裂解體系中核酸的濃度達到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來 (當然，得率可能會降低)。知道這一點的意義在于：不要迷信標準方法的唯一性；相反，當使用標準方法碰到問題 – 主要是純度問題時，完全可以通過調(diào)整沉淀條件來改善。最有參考價值的是的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個問題就是，要堅信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會降低核酸的得率，但因為可以大大提高純度。
2) 沉淀劑的選擇：醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我們并沒有發(fā)現(xiàn)這二者對質(zhì)量有大的影響。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現(xiàn)象，少量核酸用異丙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我們沒有碰到過，我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底。當然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml 離心管內(nèi)完成。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時間使沉淀最終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會有問題的。當然，沉淀所用的試劑，不僅僅就乙醇和異丙醇，還有包括PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀，雖然它們遠沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。 3) 沉淀溫度的選擇：如果核酸抽提的起始樣品是雜質(zhì)比較多時，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當核酸濃度很低時，效果明顯；當核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導致雜質(zhì)的大大增加。
（四）核酸的洗滌
洗滌原理與目的：洗滌對于整個提取過程來說，也是非常重要的。洗滌，首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要控制一定的時間，尤其是當核酸沉淀比較大時 (使核酸沉淀最終蓬松；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。大部分資料中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一說法，對于質(zhì)量好的離心管，如果離心管是經(jīng)過硅化的，因為液體幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非?？捎^，其殘留量多到會影響后續(xù)的實驗。避免液體殘余的一個好方法，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。還有需大家牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。這步，切忌不要用手甩，這樣容易將核酸甩掉。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點，洗滌次數(shù)也要考慮增加。當然，乙醇濃度的選擇也非常重要，一般情況，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。
（五）核酸的溶解和保存
1）核酸溶解：純化后的核酸，其中 RNA 以水溶解為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，其中原因是有人認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風險；如果操作過程控制得當，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。
2）核酸保存：基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。一般的我們選擇，-20℃或-70℃保存的穩(wěn)定。如果溫度不合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導致的水解(RNA 在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適。還有一個不為人重視的，就是EP 管對核酸的影響。首先一定要堅信一點，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應，達到某種均衡。EP 管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現(xiàn)象可能觀察不到；當核酸濃度很低時，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實驗所證明，但許多實驗人員并沒有將該建議當回事?，F(xiàn)在制造 EP 管的材料遠多于過去。這些新出現(xiàn)的材料，在強度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP 材質(zhì)要好許多，但其化學特征，尤其是對核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠沒有研究透徹。正如現(xiàn)在的質(zhì)?？梢愿脑斓迷絹碓竭m用某些要求一樣，其負面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn) denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。（六）核酸的濃縮
應用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收?；厥盏暮怂峥砂此铦舛?，再溶于適當?shù)木彌_液中。
核酸濃縮的具體操作時，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價陽離子鹽貯存液2V無水乙醇，混勻，放冰水浴中15～30min，取出目測平衡，0～4度，12000g，離心10min。吸棄上清，再另70%乙醇0.5～1ml，12000g，0～4度洗滌離心2min。吸棄上清，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后，溶于適當體積的緩沖液中。單價陽離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時應避免用醋酸銨，因銨離子是T，多核苷酸激酶的強烈抑制劑。當用較高濃度的乙醇沉淀RNA時，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應使用NaCl，這時該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸鈉（pH5.2 ）。
六、核酸質(zhì)量的檢測問題
將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實驗，是唯一可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實驗前檢測核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍)，該方法還是非?？尚诺?；電泳還可以用于估計核酸的濃度，但其準確度與經(jīng)驗有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗有關(guān)。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時進行紫外和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判斷。但由于 這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實驗而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實驗，也不用大驚小怪。
關(guān)于紫外分光光度儀的檢測。首先，不要使用不能選擇波長的儀器；使用那些已經(jīng)固定了波長的儀器，大概可以算是你夢魘的開始 (沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當真，其中280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。)。其次，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器；最后，要記住讀數(shù) A230 ：A260 ：A280 = 1：2 (DNA 為 1.8) ：1 為理論上的數(shù)據(jù)，實際測定時會有一些差別；但如果差別太大，就有問題了，有兩個值得商榷的觀點：如果 A260/A230 > 2 就是純的，如果 A260/A280 > 2 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大許多，一定是有雜質(zhì)殘留的 (具體是什么雜質(zhì)我不知道)。如果核酸抽提好后立即就測定，A260/A280 > 2.0 決不提示核酸降解，原因是：那些能導致 A260/A280 > 2.0 的核酸片段非常小，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你儀器提供的 A260/A280 實際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。純的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰頂，在 A280 則正好是半山坡。根據(jù)曲線在底和頂?shù)男甭首钚?，在半山坡的斜率最大的特點，不難得出如下結(jié)論：A230 和 A260 的讀數(shù)受儀器準確性的影響比較小，而 A280 受儀器準確性的影響比較大。關(guān)于電泳檢測，觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。因此，當凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。
建議先電泳檢測，再用紫外分光光度儀檢測。電泳后，可以看到哪些樣品根本就不能用 (如降解太厲害)，以及核酸的大致濃度，這樣就為紫外分光光度儀的檢測提供了一個參考 (降解的不必要測了，要測的該取多少量等)。
七、核酸中雜質(zhì)的去除
對于一些對核酸純度要求較高的實驗，我們就需要對其進行特殊的處理，除去其中的多糖、蛋白質(zhì)及非目的核酸，其方法如下：
（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化學性質(zhì)與核酸有許多相似之處，常在提取液中殘存下來。除去的方法常有：①取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動物饑餓數(shù)天然后殺死，可使細胞內(nèi)肝糖元大大減少。②加入淀粉酶，將大分子多糖分解為小分子，在以后純化步驟中逐漸被除去。③在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下層水相，核酸在上面有機層中。④以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離。
（2）蛋白質(zhì)的除去：由于核酸在細胞內(nèi)以核蛋白體形式存在，不論采用哪種方法提取核酸，蛋白質(zhì)都不同程度地存在于體系中。因此，除去蛋白質(zhì)是核酸分離純化不可避免的步驟。常用方法有下列幾種：①加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分離純化各階段均可反復使用此法。去污劑與氯仿法或苯酚法結(jié)合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提，蛋白質(zhì)在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常反復使用。③苯酚水溶液抽提，在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，DNA或RNA都可以進入水相，蛋白質(zhì)則沉淀于酚層，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，殘余的酚可用葡聚糖凝膠G-10或G-25除去。
（3）不同類型核酸的分離：兩種類型核酸的制備過程中，DNA制品中混雜著少量RNA或RNA制品中混雜著少量DNA是經(jīng)常發(fā)生的。由于DNA和RNA結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都很相似，而且分子量都十分大，所以兩類核酸的分離是核酸純化工作中比較復雜和繁瑣的一步。
從DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA，這是比較有效的方法，但使用的核糖核酸酶中常含有極微量的脫氧核糖核酸酶，必須事先加熱處理除去，然后將純凈的核糖核酸酶與樣品溶液一起在37℃孵育數(shù)分鐘，就可達到破壞RNA的目的。②鈣鹽分步沉淀：在核酸溶液中加入1/10體積10%的氯化鈣溶液，使DNA與RNA均成為鈣鹽后，再利用DNA鈣鹽在2/10體積乙醇中能形成沉淀析出，RNA鈣鹽不形成沉淀而彼此分離。③活性炭吸附：將處理好的活性炭按1/15～1/20體積加入每毫升含有0。5～1mgDNA溶液中，0～4。C下攪拌1h ，以31000×g離心1h，除去RNA后的DNA回收率可達94%。
在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是較有效和常用的方法。在沒有陰離子化合物存在下，以等體積90%苯酚水溶液反復抽提RNA，可以除去絕大部分DNA。此外，也可采用加入脫氧核糖核酸酶處理，破壞DNA，或參考上述DNA與RNA分離方法將DNA除去。?。?）同類核酸的分離：①RNA混合物的分離：經(jīng)過提取的初步純化的RNA制品中含有各類RNA和某些已降解的RNA混雜物。進一步純化時，多應用柱層析、梯度離心及逆流分溶等方法。例如tRNA與rRNA的分離用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后，以不同梯度氯化鈉溶液洗脫，或用蔗糖梯度（頂部5%濃度，底部20%濃度）離心法分開。mRNA的代謝速度較快，在細菌中平均壽命為90min，在哺乳動物中約為幾小時至十幾小時，常用密度梯度離心法和DNA-瓊脂柱進行分離。制備rRNA時，由于共沉作用，?；煊衜RNA，一般可用萘-1，5-二磺酸處理，使二者分開。各種tRNA的提純，通常采用逆流分溶法在磷酸緩沖液-甲酰胺-異丙醇系統(tǒng)下進行，分離效果較好。②DNA混合物的分離：主要是變性或降解的DNA和天然的分離，常用磷酸鈣、ECTEOLA-纖維素、DEAE-纖維素和甲基化白蛋白柱層析，逆流分溶，梯度離心等方法。一個具有生物活性高度提純的DNA制品應具有如下標準：不含有蛋白質(zhì)及多糖；不含有可透析的小分子雜物；在pH7時紫外吸收最大值在257～261μm之間，E（P）在6600左右；不含有RNA；固體為纖維狀，水溶液具有高的粘度并有流動雙折射作用；具有電泳均一性及超離心中單分散性；具有生物活性。
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