用于組氨酸標(biāo)簽蛋白純化的Ni親和磁珠
1. 組氨酸標(biāo)簽蛋白
蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能與多種金屬離子（Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+等）發(fā)生特殊的相互作用，這些作用包括配位結(jié)合、靜電吸附、共價(jià)鍵結(jié)合，其中以配位結(jié)合為主，而且這其中又以His-Tag標(biāo)簽成為蛋白純化的首選標(biāo)簽：
a) N末端的His-Tag與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制兼容，有利于蛋白表達(dá)；
b) 采用固定化金屬離子親和層析純化His-tag融合蛋白操作簡(jiǎn)便；
c) His-Tag對(duì)目的蛋白本身特性幾乎沒(méi)有影響，而不像GST標(biāo)簽?zāi)菢尤菀仔纬啥唧w，從而影響蛋白特性；
d) His-Tag非常小，不會(huì)改變目的蛋白自身的可溶性，相反一些大的標(biāo)簽如MBP，可大大提高融合蛋白的可溶性，盡管目的蛋白本身是不可溶或者折疊不正確；
e) His-Tag非常小，在融合蛋白結(jié)晶后對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響；
f) N末端的His-Tag可通過(guò)蛋白內(nèi)切酶去除；
g) His-Tag既可用于活性蛋白表達(dá)的純化標(biāo)簽，也可用于包涵體表達(dá)的純化標(biāo)簽。
在重組蛋白末端融合多個(gè)組氨酸成串的肽段（如圖1-1），憑借其與二價(jià)金屬離子的螯合作用（如圖1-2），從而利用親和作用純化蛋白。標(biāo)簽長(zhǎng)度及暴露程度常影響標(biāo)簽與金屬離子的相互作用，常用的His標(biāo)簽是6個(gè)重復(fù)的組氨酸，但在實(shí)際操作過(guò)程中，根據(jù)實(shí)際情況可控制組氨酸數(shù)目從4-10個(gè)不等。較短的標(biāo)簽與金屬離子的結(jié)合更弱，較長(zhǎng)的標(biāo)簽與金屬離子的結(jié)合更強(qiáng)；而金屬離子只能和蛋白表面的 His 結(jié)合，所以 His 標(biāo)簽暴露程度越高，結(jié)合能力越強(qiáng)。金屬螯合親合層析（Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC，如圖1-3），為His-Tag純化標(biāo)簽的重組蛋白質(zhì)的分離純化提供了一個(gè)有力的工具。
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圖1-1. His-Tag綠色熒光蛋白 |
圖1-2. His-Tag與Ni2+的螯合作用 |
圖1-3. 金屬螯合親合層析柱 |
His-Tag標(biāo)簽也存在一些缺點(diǎn)，主要有：
a) His-Tag有可能被降解脫落；
b) 在金屬離子存在下可能形成二聚體或四聚體；
c) 在其它蛋白含相鄰組氨酸殘基的情況下，洗脫時(shí)可能會(huì)帶入雜蛋白。
1. His-Tag蛋白磁分離純化流程
傳統(tǒng)的His-Tag蛋白多利用金屬螯合親合層析柱進(jìn)行層析分離。磁性納米粒子作為一種新型的介質(zhì)，利用其在磁場(chǎng)下可快速分離的特點(diǎn)，通過(guò)在磁珠表面螯合Ni2+離子，進(jìn)而將其用于His-Tag蛋白的純化，具有速度快、容易放大、可自動(dòng)化操作等諸多優(yōu)點(diǎn)。His-Tag蛋白通過(guò)磁性介質(zhì)進(jìn)行分離純化的一般流程是裂解、吸附、洗滌、洗脫四個(gè)步驟，如圖1-4所示，在流程中經(jīng)常在洗脫步驟之前增加若干洗滌步驟以除去吸附較弱的非His-Tag蛋白，以期獲得純度更高的目標(biāo)蛋白。
pH是影響蛋白結(jié)合和洗脫的重要因素，一般來(lái)說(shuō)，結(jié)合發(fā)生在中性偏堿的環(huán)境（6.5 - 8.0），洗脫多在偏酸性的環(huán)境（< 6.0）。His標(biāo)簽蛋白在中性或弱堿性pH值（pH7到8）環(huán)境下顯現(xiàn)出比在酸性條件下與金屬離子更強(qiáng)的結(jié)合能力。在磷酸緩沖液中His標(biāo)簽蛋白表現(xiàn)出比在Tris-HCl緩沖液中與金屬離子更強(qiáng)的結(jié)合能力。咪唑由于可以和His標(biāo)簽蛋白競(jìng)爭(zhēng)與金屬離子的結(jié)合，所以緩沖液中咪唑濃度的升高，會(huì)導(dǎo)致His標(biāo)簽蛋白與金屬離子結(jié)合能力的減弱。一些可以鰲合Ni離子的試劑如EDTA或檸檬酸等等蛋白與金屬離子的結(jié)合能力有較大影響，應(yīng)避免使用。蛋白分離過(guò)程主要涉及細(xì)胞裂解結(jié)合液、洗滌液和洗脫液。
a) 細(xì)胞裂解結(jié)合液Lysis buffer（Buffer pH，Salt concentration，Stabilizer）
pH：>pI還是<pI；
NaCl：100-300 mM；
Glycerol：5-15 %,…CPI, mild detergent, β-ME
b) 洗滌液Washing Buffer
Lysis buffer + imidazole (1-40 mM) varies from protein to protein
c) 洗脫液Elution Buffer
Lysis buffer + 100-300 mM imidazole
圖1-4. 磁性介質(zhì)分離純化His-Tag蛋白的一般流程
緩沖液配置基本原則：低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或高pH上樣，低pH洗脫，如圖1-5。
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a) pH對(duì)組氨酸電離的影響 |
b) 咪唑與組氨酸的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 |
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圖1-5. 組氨酸標(biāo)簽蛋白洗脫原理
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固定化金屬親和磁珠（immobilized metal affinity magnetic bead, IMAMB）可以用于可溶性蛋白和包涵體蛋白的純化，兩種方法所需緩沖液不同，具體配置方法表1-1和表1-2。
表1-1. 可溶性組氨酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方
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名稱(chēng) |
體積 |
配方 |
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結(jié)合緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06 g Tris) |
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清洗緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06 g Tris) |
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洗脫緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06 g Tris) |
表1-2. 包涵體組氨酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方
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名稱(chēng) |
體積 |
配方 |
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結(jié)合緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06g Tris) |
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清洗緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06g Tris) |
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洗脫緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06g Tris) |
上述緩沖液體系適用于多數(shù)組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化，在結(jié)合緩沖液中添加一定濃度的咪唑可以降低非特異性結(jié)合，提高目的蛋白的純度。初次使用的客戶(hù)，可以采用推薦的緩沖液，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整緩沖液配方及緩沖液中的咪唑濃度。
固定化金屬離子介質(zhì)是非常穩(wěn)定的，但在有螯合劑的情況下其金屬離子就會(huì)脫落，所以在純化His-Tag融合蛋白時(shí)，通常螯合劑EDTA和EGTA必須從溶液中去除。Audur Magnusdottir等人認(rèn)為，在E. coli的裂解液普遍存在一些非特異的弱螯合劑，如在三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生了二羧酸類(lèi)物質(zhì)；E. coli在面臨某些壓力情況下，會(huì)產(chǎn)生高特異性的金屬螯合劑——Metallophores，這是由于這些螯合劑的存在導(dǎo)致His-Tag融合蛋白純化的純度和產(chǎn)量大大降低。這些螯合劑一般存在于細(xì)菌的細(xì)胞周質(zhì)中，可通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的步驟除去這些螯合劑，使得His-TagTM蛋白的純度和產(chǎn)量得到提高。固定化金屬離子介質(zhì)通常需要考慮在表1-3所列試劑中的穩(wěn)定性。
表1-3. 固定化金屬離子介質(zhì)穩(wěn)定性考察因素
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Reagents |
Stability |
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Reductants 還原劑 |
5 mM DTE 0.5-1mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione |
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Denaturants 變性劑 |
8 M urea 6 M Gua-HCl |
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Detergent 表面活性劑 |
2% Triton? X-100 (nonionic) 2% Tween? 20 (nonionic) 2% NP-40 (nonionic) 2% cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic) |
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Other additives 其它添加劑 |
500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate |
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Buffer 緩沖液 |
50 mM sodium phosphate, pH 7.4 100 mM Tris-HCl, pH 7.4 100 mM Tris-acetate, pH 7.4 100 mM HEPES, pH 7.4 100 mM MOPS, pH 7.4 100 mM sodium acetate, pH 4 |
PuriMag鎳磁珠以其高結(jié)合率、快磁響應(yīng)、操作簡(jiǎn)單、提取蛋白純度高等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，受到廣大客戶(hù)的肯定。
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