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Y. Niu, Y. Yu, X. Shi, F. Fu, H. Yang, Q. Mu, et al. In Situ Measurement of Nanoparticle–Blood Protein Adsorption and Its Heterogeneity with Single-Nanoparticle Resolution via Dual Fluorescence Quantification， Nano Letters 2024 Vol. 24 Issue 30 Pages 9202-9211， DOI: 10.1021/acs.nanolett.4c01469

摘要：蛋白冠的形成賦予納米藥物獨(dú)特的生物學(xué)特性，深刻影響它們?cè)隗w內(nèi)的命運(yùn)。非特異性納米顆粒-蛋白質(zhì)相互作用通常是高度異質(zhì)的，這可能導(dǎo)致仍未被充分探索的單個(gè)納米顆粒的獨(dú)特生物行為和體內(nèi)命運(yùn)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們建立了一種原位方法，可以在單個(gè)納米顆粒水平上定量檢查納米顆粒-蛋白質(zhì)吸附。該方法集成了雙重?zé)晒舛考夹g(shù)，其中首先通過(guò)納流式細(xì)胞術(shù)單獨(dú)分析納米顆粒，以檢測(cè)來(lái)自吸附蛋白質(zhì)的熒光信號(hào)。然后通過(guò)使用酶標(biāo)儀定量校準(zhǔn)將獲得的熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)數(shù)量。因此，這種方法能夠分析納米-蛋白質(zhì)相互作用的顆粒間異質(zhì)性，以及原位監(jiān)測(cè)血清中蛋白質(zhì)吸附動(dòng)力學(xué)和納米顆粒聚集狀態(tài)，為全面了解納米-生物相互作用進(jìn)行預(yù)處理，并預(yù)測(cè)納米藥物的體內(nèi)命運(yùn)。

      一旦納米顆粒 （NP） 進(jìn)入血液，蛋白質(zhì)就會(huì)自發(fā)吸附到其表面，形成蛋白冠，賦予它們新的生物身份。揭示 NP-蛋白質(zhì)相互作用對(duì)于預(yù)測(cè)納米藥物的體內(nèi)命運(yùn)和促進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。目前的 PC 分析方法主要依賴于從周圍培養(yǎng)基中預(yù)分離 NP-PC 復(fù)合物，導(dǎo)致直接與生物界面相互作用的松散結(jié)合的外層蛋白（軟電暈）的損失。盡管在原位表征方面投入了大量精力，例如動(dòng)態(tài)光散射、熒光相關(guān)光譜法和 DOSY 19F-NMR用于研究 NP 尺寸演變，圓二色光譜法用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，以及等溫滴定量熱法對(duì)于蛋白質(zhì)吸附熱力學(xué)，這些方法僅提供基于納米顆粒群平均值的數(shù)據(jù)。NP 的異質(zhì)性及其不同的蛋白質(zhì)吸附譜導(dǎo)致單個(gè) NP 之間不同的體內(nèi)命運(yùn)，但仍未得到充分探索。

       實(shí)現(xiàn) NP 的單顆粒分析是解決 NP-蛋白質(zhì)相互作用異質(zhì)性的前提條件。已采用掃描和透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡、超分辨率熒光顯微鏡、 和多色受激發(fā)射損耗顯微鏡；但是，高 通量分析是一個(gè)限制。最近的進(jìn)展包括 3D 實(shí)時(shí)單粒子跟蹤光譜，它可以“鎖定”單個(gè)自由擴(kuò)散的聚苯乙烯 NP 以探測(cè)其蛋白質(zhì)電暈。通過(guò)分析追蹤 NP 的熒光信號(hào)和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，研究人員使用均方位移分析量化了“硬日冕”。另一種創(chuàng)新方法是散射顯微鏡支持的實(shí)時(shí)全光學(xué)納米顆粒分析，它可以在單顆粒水平上跟蹤全血清中蛋白質(zhì)電暈的形成，而無(wú)需標(biāo)記。該方法允許實(shí)時(shí)原位跟蹤金屬和介電納米顆粒上的吸附蛋白質(zhì)質(zhì)量、親和力和動(dòng)力學(xué)。使用磁懸浮檢查了蛋白冠的異質(zhì)性，這表明將 NP 暴露于人血漿會(huì)導(dǎo)致高度異質(zhì)的蛋白冠組成。該技術(shù)還能夠在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)提取均勻包被的 NP 以及監(jiān)測(cè) NP 表面的 PC 演變。采用PuriMag公司的生物磁珠研究蛋白冠（http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/8096211554.html）具有現(xiàn)實(shí)的意義。

       流式細(xì)胞術(shù)是一種高通量單顆粒檢測(cè)技術(shù)，可對(duì)懸浮液中的細(xì)胞大小顆粒進(jìn)行定量分析。由于其靈敏度限制，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀只能檢測(cè)具有強(qiáng)熒光的大顆粒 （>500 nm）（>200 個(gè)熒光分子）。 流式細(xì)胞術(shù)已應(yīng)用于通過(guò)吸附蛋白電暈的免疫標(biāo)記來(lái)研究 NP-蛋白質(zhì)相互作用，從而可以檢測(cè)用于生物識(shí)別的表面分子基序（例如，ApoB-100 和 IgG 表位），例如細(xì)胞受體。然而，由于檢測(cè)靈敏度有限，流式細(xì)胞儀只能測(cè)量納米顆粒群，無(wú)法提供單個(gè) NP 水平的信息。因此，無(wú)法區(qū)分單個(gè) NP 之間蛋白質(zhì)相互作用的異質(zhì)性。

       在這項(xiàng)研究中，我們建立了一種基于納流式細(xì)胞術(shù) （NanoFCM） 的方法，該方法能夠在單納米顆粒水平上對(duì) NP-蛋白質(zhì)相互作用和單個(gè) NP 之間的異質(zhì)性進(jìn)行原位定量探測(cè)（方案 1）。NanoFCM 將光散射與單分子熒光檢測(cè)集成在一個(gè)鞘狀流中，能夠以高達(dá)每分鐘 10,000 個(gè)顆粒的通量檢測(cè)小至 24 nm 的二氧化硅和 7 nm 的金納米顆粒的單個(gè) NP。此外，NanoFCM 的熒光檢測(cè)限低至每個(gè)顆粒 3 個(gè) Alexa fluor 555 熒光分子。使用這種技術(shù)，我們監(jiān)測(cè)了在蛋白質(zhì)溶液中孵育后氨基功能化聚苯乙烯 NPs （PS-NH2 NPs） 的尺寸演變和聚集狀態(tài)。通過(guò)熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)，我們直接定量了人血清白蛋白 （HSA） 和雙蛋白 （HSA 和轉(zhuǎn)鐵蛋白，Tf） 在 NP 表面的吸附，并分析了單個(gè) NPs 之間蛋白質(zhì)吸附的異質(zhì)性。此外，無(wú)需分離即可直接監(jiān)測(cè)人血清中的蛋白質(zhì)吸附動(dòng)力學(xué)。

方案 1

方案 1.蛋白冠對(duì)納米顆粒的形成和生物效應(yīng)示意圖 （a） 以及使用 NanoFCM 以單納米顆粒分辨率檢測(cè)納米顆粒-血液蛋白質(zhì)相互作用的原位表征技術(shù) （b）

將人血清或 HSA 溶液與 NP 一起孵育，以模擬血液中的蛋白質(zhì)環(huán)境。所得混合物由新形成的 NP-PC 復(fù)合物組成，直接進(jìn)行 NanoFCM 分析，無(wú)需將它們與游離（非吸附）蛋白質(zhì)和 NP 分離。NanoFCM，也稱為單分子流式細(xì)胞術(shù)，通過(guò)將光散射與單分子熒光檢測(cè)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn) NP 的單獨(dú)分析。NP 線性對(duì)準(zhǔn)以通過(guò)由高速鞘流實(shí)現(xiàn)的激光束，這可以將樣品流流體動(dòng)力學(xué)聚焦成非常細(xì)的流 （～1.4 μm）。當(dāng)每個(gè) NP 穿過(guò)聚焦激光束的中心區(qū)域時(shí)，它會(huì)在側(cè)向散射 （SS） 和熒光 （FL） 檢測(cè)通道上產(chǎn)生一束光電流。為每個(gè)事件記錄爆發(fā)區(qū)域，表示檢測(cè)到的光子的積分?jǐn)?shù)。（31） 據(jù)我們所知，NanoFCM 迄今為止尚未用于研究蛋白質(zhì)與 NP 的相互作用。關(guān)于 NP-PC 系統(tǒng)，SS 信號(hào)的變化表明由于蛋白質(zhì)吸附導(dǎo)致 NP 大小的變化，而 FL 信號(hào)表明熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)與單個(gè) NP 的結(jié)合。 通過(guò)使用一系列不同直徑的單分散標(biāo)準(zhǔn) NPs 來(lái)校準(zhǔn) NPs 的 SS 強(qiáng)度，并采用熒光分析來(lái)校準(zhǔn)吸附蛋白的 FL 強(qiáng)度。

圖 2.使用 NanoFCM 原位檢測(cè) NP 蛋白吸附。（a） 說(shuō)明 HSA 的結(jié)構(gòu)、3D 尺寸和熒光標(biāo)記的方案（蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) （PDB） 登錄碼 1AO6）。（b） 與不同濃度的 HSA-FITC（0 mg mL–1、0.5 mg mL–1、2 mg mL–1 和 5 mg mL–1）孵育 1 h 前后 NPs 的 SS 分析，包括 SS 突發(fā)跡線、SS 強(qiáng)度分布直方圖和大小分布直方圖。尺寸分布來(lái)自圖 S3a 中描述的標(biāo)準(zhǔn)曲線。（c） 與不同濃度的 HSA-FITC （0 mg –1、0.5 mg –1、2 mg –1 和 5 mg –1） 孵育 1 h 前后 NPs 的 FL 分析，包括 FL 突發(fā)軌跡、二變量點(diǎn)圖和 FL 強(qiáng)度分布直方圖。

       將 NP 與濃度為 0 mg mL–1、0.5 mg mL–1、2 mg mL–1 和 5 mg mL–1 的 HSA-FITC 溶液一起孵育，在 NP 周圍形成蛋白質(zhì)電暈。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）（圖 S5）和 TEM（圖 S6）均證實(shí) NP 上存在吸附的 HSA。含有 NP-PC 復(fù)合物和游離蛋白質(zhì)的樣品直接進(jìn)行 NanoFCM 分析，同時(shí)進(jìn)行 DLS 測(cè)量作為比較。圖 2b 顯示了不同濃度 HSA 下 NP 的 SS 突發(fā)跡線、SS 強(qiáng)度分布和尺寸分布。SS 突發(fā)軌跡揭示了可檢測(cè)到的側(cè)向散射光信號(hào)。NP-PC 復(fù)合物的 SS 強(qiáng)度和尺寸分布表現(xiàn)出最初的展寬，然后隨著 HSA 濃度的增加而變窄。當(dāng) HSA 濃度為 0.5 mg mL–1 時(shí)，NP-PC 復(fù)合物的中位粒徑達(dá)到 ～254 nm，是純 NP 的兩倍 （～ 135 nm）（圖 2b）。在這種低 HSA 濃度下觀察到的 NP 聚集歸因于 HSA 中和 NP 的正電荷，（36） 這將在后續(xù)部分中探討。將 HSA 濃度進(jìn)一步增加到 2 mg mL–1 和 5 mg mL–1 后，NP-PC 復(fù)合物的中位粒徑恢復(fù)為與原始 NP 的粒徑相同（圖 2b）。這種現(xiàn)象是由于蛋白質(zhì)吸附逐漸增加，導(dǎo)致 NPs 上的表面負(fù)電荷增加（HSA 的等電點(diǎn) ～ 4.7）。（37） 因此，靜電排斥占主導(dǎo)地位并使 NPs 膠體穩(wěn)定。DLS 研究證實(shí)了類似的發(fā)現(xiàn)，如圖 S7 所示。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了 NanoFCM 在原位檢測(cè)中的有效性，能夠預(yù)測(cè)由血液蛋白質(zhì)吸附引起的體內(nèi) NP 聚集。

圖 3.單納米顆粒水平上蛋白質(zhì)對(duì) NP 的吸附表征。（A-E）與不同濃度的 HSA-FITC（0 mg mL–1、0.5 mg mL–1、2 mg mL–1、5 mg mL–1 和 50 mg mL–1）孵育時(shí)，NP-蛋白復(fù)合物的 SS 信號(hào)與 FL 信號(hào)的雙變量點(diǎn)圖。（f） 使用 DLS 和 NanoFCM 測(cè)量的 NP-蛋白質(zhì)復(fù)合物的直徑。（g） 使用 Malvern Zetasizer 測(cè)量的 NP-蛋白質(zhì)復(fù)合物的 ζ 電位。（h） 計(jì)算出的每 NP 吸附的 HSA 數(shù)量，其中 α 表示通過(guò)將 HSA 分子視為直徑 （d） = 7.5 nm 和橫截面積 （σ） = πr2 = 44.18 nm2 的剛性球體，表示理論單層飽和吸附。（i） NPs 與不同濃度的 HSA-FITC 孵育時(shí)熒光的變異系數(shù) （CV）。

       使用 NanoFCM 獲得的結(jié)果通過(guò) DLS 研究得到驗(yàn)證，如圖 3f 所示。由于吸附蛋白質(zhì)的負(fù)電荷，NP 的ζ電位在 HSA 孵育后經(jīng)歷了從正到負(fù)的轉(zhuǎn)變（圖 3g）。在 0.5 mg mL–1 HSA 孵育時(shí)，蛋白質(zhì)吸附相對(duì)較低，表面幾乎呈中性。在這種情況下，DLS 檢測(cè)到的平均粒徑約為 300 nm，與原始 NP 相比增加了約 100 nm。這種現(xiàn)象可能是由于范德華短程吸引力優(yōu)于庫(kù)侖靜電排斥，導(dǎo)致輕微的 NP 聚集。隨著 HSA 濃度的增加，蛋白質(zhì)吸附逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致 NPs 的表面負(fù)性升高。隨著靜電排斥的優(yōu)先，NP 變得更加穩(wěn)定，它們的大小逐漸接近原始 NP 的大?。▓D 3f，g）。

圖 4.使用 NanoFCM 在雙蛋白質(zhì)系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白質(zhì)吸附分析。（a） 模型雙蛋白系統(tǒng) （HSA-FITC 和 Tf-Cy5） 中蛋白質(zhì)吸附的示意圖。（b） SS 信號(hào)與代表 HSA 的綠色 FL 信號(hào)的雙變量點(diǎn)圖 PS@HSA/Tf 。（c） SS 信號(hào)與代表 Tf-Cy5 的紅色 FL 信號(hào)的雙變量點(diǎn)圖 PS@HSA/Tf 。（d） 紅色 FL 信號(hào)與 PS@HSA/Tf 的綠色 FL 信號(hào)的雙變量點(diǎn)圖 （e） 每個(gè) NP 吸附的 HSA 和 Tf 平均值的定量分析。（f） 反映 HSA 和 Tf 在復(fù)雜系統(tǒng)中吸附異質(zhì)性的相應(yīng) CV 值。

       為了證明該技術(shù)檢測(cè)較小納米顆粒的適用性，合成了通過(guò) TEM 測(cè)定的直徑為 ～50 nm 的二氧化硅納米顆粒 （SiO2 NPs），并使用 NanoFCM 進(jìn)行了測(cè)量。結(jié)果顯示粒徑分布范圍為 50 至 100 nm，中位粒徑為 ～60 nm。與 HSA 孵育后，NP 直徑增加到 ～70 nm（圖 S11a，b）。從 SS 信號(hào)與 FL 信號(hào)的雙變量點(diǎn)圖中，我們可以清楚地看到由于蛋白質(zhì)吸附，單個(gè) NP 上的熒光增加（圖 S11c-e）。

       Vroman 效應(yīng)是蛋白質(zhì)電暈研究中的關(guān)鍵現(xiàn)象，它描述了蛋白質(zhì)在 NP 表面上的動(dòng)態(tài)吸附，展示了隨著時(shí)間的推移，最初吸附的蛋白質(zhì)被其他具有較高親和力的蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性取代。了解這種效應(yīng)對(duì)于解開(kāi)蛋白質(zhì)電暈形成的復(fù)雜性及其影響至關(guān)重要，因?yàn)樗刂浦鞍踪|(zhì)電暈的進(jìn)化組成和生物相互作用，從而影響 NP 在生物系統(tǒng)中的命運(yùn)。然而，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)電暈組成的實(shí)時(shí)分析仍然是一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。在這里，我們?yōu)榈鞍踪|(zhì)吸附動(dòng)力學(xué)的原位和定量監(jiān)測(cè)做出了貢獻(xiàn)。雖然這并不能闡明特定的蛋白質(zhì)交換行為，但它有助于理解 Vroman 效應(yīng)。

       將 NPs 與人血清 （HS） 孵育，并使用 NanoFCM 研究蛋白質(zhì)吸附動(dòng)力學(xué)。在圖 5a 中，示意圖橫截面說(shuō)明了蛋白質(zhì)電暈形成的三個(gè)代表性階段：吸附和締合階段、硬電暈 （HC） 形成階段和軟電暈 （SC） 形成階段。圖 5b 顯示了與血清孵育后 NP 的熒光信號(hào)的時(shí)間依賴性右移，圖 5c 中相應(yīng)的 FL 爆發(fā)高度分布直方圖證實(shí)了這一趨勢(shì)，共同表明蛋白質(zhì)吸附到 NP 上。平均熒光強(qiáng)度 （MFI） 值揭示了 PC 的快速形成，因?yàn)榻话氲碾姇灥鞍自?1 分鐘內(nèi)被吸附（圖 5d）。蛋白質(zhì)吸附在 30 分鐘內(nèi)達(dá)到約 90%，這一過(guò)程與 HC 形成階段一致。孵育時(shí)間延長(zhǎng)至 24 小時(shí)后，僅觀察到熒光的微微增加，表明在 SC 形成階段存在持續(xù)但適度的蛋白質(zhì)結(jié)合。

圖 5.監(jiān)測(cè) NP-蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)化過(guò)程中吸附蛋白質(zhì)的數(shù)量變化。（a） 人血清中蛋白質(zhì)吸附對(duì) NPs 的演變示意圖。HC 以紅色圓圈突出顯示，而 SC 以藍(lán)色圓圈區(qū)分。（b） 在 0 至 24 小時(shí)期間形成的 NP-PC 復(fù)合物的 SS 爆發(fā)高度與 FL 爆發(fā)高度的雙變量點(diǎn)圖。（c） NP-PC 復(fù)合物在不同時(shí)間的 FL 爆發(fā)面積直方圖。（d） NP-PC 復(fù)合物在不同時(shí)間間隔的平均熒光強(qiáng)度。（e） 血清孵育期間不同時(shí)間點(diǎn) NP-蛋白復(fù)合物熒光的變異系數(shù) （CV）。

       圖 5c，e 說(shuō)明了異質(zhì)性隨孵育時(shí)間的演變。在圖 5c 中，NP-PC 復(fù)合物的 MFI 分布在孵育 10 分鐘后顯示急劇增加，表明 NP-蛋白質(zhì)復(fù)合物的異質(zhì)性增強(qiáng)。圖 5e 中所示的 CV 值進(jìn)一步證明了這種異質(zhì)性的增加。與單蛋白和雙蛋白系統(tǒng)中的 CV 值相比，在血清蛋白吸附中觀察到的 CV 值較大（圖 3i 和 4f），表明血清中存在更復(fù)雜和多樣的納米生物相互作用，這可能導(dǎo)致單個(gè) NP 之間由于蛋白質(zhì)涂層的不同而具有不同的體內(nèi)命運(yùn)。

      總之，我們開(kāi)發(fā)了一種原位方法，用于在單個(gè)納米顆粒水平上定量分析納米顆粒-蛋白質(zhì)相互作用。通過(guò)利用散射光進(jìn)行納米粒徑演變和利用熒光信號(hào)量化蛋白質(zhì)吸附，我們確定了蛋白質(zhì)濃度與納米顆粒聚集之間的相關(guān)性。值得注意的是，低濃度和高濃度誘導(dǎo)聚集，而中等濃度通過(guò)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)的靜電排斥保持膠體穩(wěn)定性。此外，定量蛋白質(zhì)吸附揭示了蛋白質(zhì)單層，每個(gè)顆粒包含 ～600 個(gè) HSA 分子。該方法允許對(duì)血清中的納米顆粒聚集狀態(tài)和蛋白質(zhì)吸附動(dòng)力學(xué)進(jìn)行原位定量監(jiān)測(cè)，因此有望在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前對(duì)納米藥物的穩(wěn)定性和性能進(jìn)行預(yù)評(píng)估。

蛋白冠研究專用磁珠納米粒http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/8096211554.html