使用親和標(biāo)簽策略表達(dá)與純化重組蛋白的及比較
重組蛋白在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越多，不僅局限于普通蛋白，也用于病毒樣顆粒等的制備。目前已經(jīng)形成了多種表達(dá)和純化策略，這些策略旨在改善蛋白質(zhì)溶解性、對宿主的毒性、低水平表達(dá)和純化困難等問題。
親和純化是利用生物分子間的親和吸附和解離而設(shè)計的蛋白純化方法，具有操作簡單、條件溫和、獲得的蛋白純度高等特點，特別適合于活性蛋白質(zhì)的純化，并且對表達(dá)量低的活性蛋白也具有良好的分離效果。重組蛋白的親和純化通常是將重組蛋白克隆到含有對固定化樹脂具有高度特異性的融合蛋白或肽標(biāo)記的表達(dá)載體中。在許多情況下，融合蛋白或肽也會增加重組蛋白的溶解性，降低對宿主細(xì)菌細(xì)胞的毒性。但帶有親和標(biāo)簽的重組蛋白也面臨一些問題，比如標(biāo)簽有時會對目的蛋白的結(jié)構(gòu)甚至生物活性產(chǎn)生消極影響，這就需要對標(biāo)簽進(jìn)行去除。
親和表達(dá)及酶切策略
1. 融合表達(dá)一個親和標(biāo)簽及用于純化后酶切的酶切位點linker
2. 親和標(biāo)簽既是純化標(biāo)簽同時也促進(jìn)目的蛋白的可溶性表達(dá)
3. 用于外切酶（ TAGZyme）在純化后從N端切除親和純化標(biāo)簽
4.部分促進(jìn)可溶性表達(dá)的序列不帶有親和標(biāo)簽，例如Trx，因此需要額外加上親和標(biāo)簽
常用的親和基質(zhì)包括：專門針對抗體的蛋白A或蛋白G親和基質(zhì)，針對生長因子和核酸結(jié)合蛋白的肝素型親和基質(zhì)，用于純化含有標(biāo)簽的融合蛋白親和基質(zhì)，以及結(jié)合了特異性抗體的親和基質(zhì)等。隨著基因重組表達(dá)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，將目的蛋白與親和純化標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，再通過親和法純化出目的蛋白，已成為實驗室最常用的一項技術(shù)。在本文中，我們將總結(jié)使用親和標(biāo)記來緩解蛋白質(zhì)溶解性宿主毒性、表達(dá)水平及純化問題這的各種策略，親和標(biāo)記去除策略，并討論蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)的未來方向。
1.主要的標(biāo)簽種類
主要融合標(biāo)簽的優(yōu)缺點比較
His-tag是目前IMAC最流行的選擇，具有尺寸小、洗脫條件溫和以及表達(dá)載體的廣泛適用性的優(yōu)點。此外，針對His-tag的抗體也可商業(yè)獲得，可用于識別表達(dá)蛋白。因此許多結(jié)晶學(xué)和核磁共振蛋白研究也采用His-tag。盡管His-tag具有許多優(yōu)點，但由于細(xì)菌裂解液中通常也含有某些金屬結(jié)合蛋白，這些蛋白也會結(jié)合到親和介質(zhì)上。因此His-tag純化的特異性較弱，如果要得到高純度的目的蛋白，還需要增加純化步驟。此外，如果樣品中含有EDTA等物質(zhì)，會使填料上的金屬離子掉落，極大的影響純化。金屬螯合通常使用IDA或NTA螯合劑，它與Ni2+、Co2+、Cu2+、Fe2+作用，形成帶有多個配位基的螯合物，固定在載體上，作為配體吸附對重金屬有特異結(jié)合能力的蛋白。例如利用基因工程構(gòu)建帶標(biāo)簽的蛋白His（組氨酸）標(biāo)簽融合蛋白，該蛋白對Ni2+等金屬離子有高選擇的特異性，因此，Ni2+等金屬離子能夠螯合His標(biāo)簽蛋白并吸附在固相載體上，而其他的蛋白質(zhì)不能結(jié)合或者僅能微弱的結(jié)合，從而能夠分離純化目標(biāo)蛋白。廈門普睿邁格公司生產(chǎn)的PuriMag系列的Ni磁珠（PuriMag Si-IDA-Ni、PuriMag Si-NTA-Ni）對于小量純化組氨酸標(biāo)簽蛋白，具有快速、實驗操作簡單的特點，非常適合于實驗室小量表達(dá)蛋白的純化驗證。
1.2 表位標(biāo)簽用于免疫親和分離表位標(biāo)記由含有已知抗原表位的多肽序列組成，且有對其有適當(dāng)親和力的特異性抗體。由于利用雜交瘤技術(shù)可獲得大量、高純度單克隆抗體，因此可將抗體固定到填料基質(zhì)上，并用于表位標(biāo)記重組蛋白的純化。
1.2.1 FLAG
FLAG標(biāo)簽是由8個氨基酸（DYKDDDDK）組成的一個短肽，分子量很小，高度親水性，因而不會遮蓋融合蛋白中其他的蛋白表位與結(jié)構(gòu)域，也不會改變?nèi)诤系鞍椎墓δ?、分泌或運輸。該標(biāo)簽具有天然的親水特性，很容易定位于融合蛋白的表面，便于利用抗體檢測；同時含有一個腸激酶切割位點（DDDK），可以利用腸激酶切除標(biāo)簽。FLAG標(biāo)簽有2個特異性的單克隆抗體，分別為M1單抗、M2單抗。FLAG短肽合成成本較高，不適用于大規(guī)模純化，且需要額外步驟除去結(jié)合在層析介質(zhì)上的短肽。
1.2.2 c-myc
c-myc標(biāo)簽（EQKLSEDEL）已被用于多種用途，如流式細(xì)胞術(shù)、免疫沉淀以及蛋白質(zhì)純化，但純化已經(jīng)很少用c-myc標(biāo)簽
1.2.3 HA
流感病毒HA標(biāo)簽包括YPYDVPDYA。和c-myc標(biāo)簽一樣，HA標(biāo)簽主要用于示蹤，檢測和純化目的蛋白。
抗原表位標(biāo)記通常被用來代替His-tag標(biāo)記，因為它們具有更高的特異性和檢測能力。然而由于免疫親和樹脂比傳統(tǒng)親和樹脂更高昂的成本，使用抗體特異性表位標(biāo)記進(jìn)行純化更適合于小規(guī)模純化。
這些蛋白標(biāo)簽通常比表位標(biāo)簽大，包含能結(jié)合至固定在親和樹脂上的特定配體的功能域/序列。
1.3.1 鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）
CBP是來自骨骼肌肌球蛋白輕鏈激酶的26個氨基酸序列，在鈣離子存在下能與鈣調(diào)蛋白結(jié)合。從鈣調(diào)素親和柱中洗脫CBP融合蛋白可以在生理條件下進(jìn)行，這使得該標(biāo)簽成為難以純化的蛋白質(zhì)（如膜蛋白）的一個吸引人的選擇。缺點是其他一些真核蛋白可能與鈣調(diào)蛋白親和樹脂相互作用。因此，CBP標(biāo)簽應(yīng)該與細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)一起使用。
1.3.2 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）
GST標(biāo)簽是一種在真核生物中發(fā)現(xiàn)的26kDa酶，能結(jié)合到配體谷胱甘肽上。GST標(biāo)簽最初用于pGEX質(zhì)粒，以促進(jìn)難以純化的真核蛋白的純化。在融合到目標(biāo)蛋白的N端時，GST標(biāo)簽可能能提高目的蛋白的可溶性及表達(dá)程度。GST可能主要通過在聚集和不適當(dāng)折疊發(fā)生前穩(wěn)定靶蛋白的折疊來改善蛋白質(zhì)的表達(dá)，而不是通過提高溶解性來改善表達(dá)。GST（谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽融合蛋白純化中，將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與重組蛋白或者多肽鏈融合，GST標(biāo)簽融合蛋白通過谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與固相載體上的還原型谷胱甘肽之間通過酶與底物之間的特異性結(jié)合，從而達(dá)到和其他蛋白分離的目的。推薦使用PuriMag Si-GSH磁珠快速純化GST標(biāo)簽融合蛋白。
1.3.3 鏈霉親和素結(jié)合肽 Strep TagII
鏈霉親和素結(jié)合標(biāo)簽僅由少數(shù)氨基酸組成，并能結(jié)合到一種細(xì)菌蛋白質(zhì)鏈霉親和素上，用于蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等的表達(dá)與純化中。多年來，Streptavidin標(biāo)簽序列從AWRHPQFGG改為NWSHPQFEK。這種新的Strep TagII標(biāo)簽允許將標(biāo)簽放置在N-末端，而不像最初只能在目標(biāo)蛋白的C-末端。與His-tag相比，StrepII的樹脂更貴，但特異性更強(qiáng)，純化純度更高，甚至可以與各種免疫樹脂相媲美，但相比之下成本顯著更低。因此，Strep TagII標(biāo)簽可能是配體標(biāo)簽中最適合大規(guī)模純化的。 Strep-tagⅡ系統(tǒng)的純化條件比較寬泛，在普通緩沖液下就可與strep-Tactin純化介質(zhì)結(jié)合，使用2.5mmol/L的脫硫生物素就可將Strep-tagⅡ融合蛋白洗脫下來，螯合劑、去污劑、還原劑 及高達(dá)1mol/L的鹽均可加入到緩沖液中。此外，Strep-tag Ⅱ在純化過程中不依賴金屬離子，十分適合含金屬離子蛋白質(zhì)的純化。推薦使用PuriMag Si-StrepTactin磁珠快速純化Strep TagII標(biāo)簽融合蛋白。
1.3.4 麥芽糖結(jié)合蛋白
MBP標(biāo)簽是一種來源于大腸桿菌的42kDa的蛋白，不含 Cys，作為融合蛋白的標(biāo)簽，通常放在 N 端在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。MBP 能促進(jìn)融合蛋白的可溶性表達(dá)，尤其對于難表達(dá)的真核細(xì)胞蛋白，膜蛋白病毒蛋白有很好的促溶表達(dá)能力。MBP對交聯(lián)的淀粉和麥芽糖具有很高的親和力。然而，MBP融合到重組蛋白的C端可能影響融合蛋白對淀粉/麥芽糖的親和力，因為融合蛋白可能會和其結(jié)合位點相互作用。因此，通常需要在MBP的N-端放置His-tag，以促進(jìn)融合蛋白的純化。MBP在提高融合蛋白的溶解性方面也非常有效。 MBP 融合蛋白的純化在生理條件下進(jìn)行， 使用麥芽糖進(jìn)行溫和洗脫。推薦使用PuriMag Si-Amylose磁珠快速純化MBP標(biāo)簽融合蛋白。
1.4.1 彈性蛋白樣多肽
ELP由20-330個五肽Val-Pro-Gly-Xaa-Gly重復(fù)組成，并通過標(biāo)簽的溫度依賴性促進(jìn)目的蛋白的純化。根據(jù)五肽重復(fù)序列的數(shù)目和序列，ELP融合蛋白在特定溫度下可經(jīng)歷可逆的相變，并從溶液中沉淀出來。這樣可以去除上清液中的其他蛋白質(zhì)，同時分離沉淀的ELP融合蛋白。ELP標(biāo)簽的一個優(yōu)點是它不需要特殊的樹脂或柱，只需離心就可以。然而，由于這一策略利用了融合蛋白的溶解性變化，因此需要考察ELP的類型以及融合的位點，以產(chǎn)生能適當(dāng)折疊和且具有生理活性的重組蛋白。
1.4.2 硫氧還蛋白A（Trx）
硫氧還蛋白A是一種12kDa的酶，催化各種還原氧化反應(yīng)。Trx能顯著降低目的蛋白形成包涵體的幾率。野生型Trx本身并不能通過親和色譜法進(jìn)行融合蛋白的純化。為了解決這一問題，突變的硫氧還蛋白被設(shè)計成具有含有組氨酸標(biāo)簽，或在體內(nèi)易生物素化，然后通過親和柱捕獲。
1.4.3 NusA
NusA是一種55kDa的大腸桿菌蛋白，其在過度表達(dá)時具有很高的溶解性，在重組蛋白表達(dá)和純化過程中能增加其融合蛋白的溶解性。與麥芽糖結(jié)合蛋白相比，盡管NusA具有非常不同的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，但其溶解性增強(qiáng)效果大致相同。由于NusA與特定的樹脂沒有很強(qiáng)的結(jié)合親和力，它被設(shè)計成具His-tag的表達(dá)載體以方便純化。
以上我們可以總結(jié)出，廣泛使用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域標(biāo)簽具有共同的特性：增加了重組蛋白的溶解性和表達(dá)水平。這兩種增強(qiáng)效應(yīng)是通過一種目前尚不清楚的機(jī)制產(chǎn)生的，因為即使是化學(xué)上不同的結(jié)構(gòu)，如MBP和NusA，也可能具有類似的蛋白質(zhì)表達(dá)和溶解作用。有假設(shè)認(rèn)為這些載體蛋白可能作為伴侶促進(jìn)來目的蛋白質(zhì)的折疊。
1.5. Protein A親和層析介質(zhì)
常用于純化和分離IgG。Protein A是一種分離自金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁蛋白，主要通過Fc片段結(jié)合哺乳動物IgG。天然Protein A有5個IgG結(jié)合域和許多其它的未知功能域。重組Protein A包含5個高IgG結(jié)合域，并去除了其它非主要結(jié)合域以降低非特異性結(jié)合。 Protein A親和層析介質(zhì)已經(jīng)廣泛用于從生物流體或細(xì)胞培液中分離純化各種類型的IgG或者IgG片段。實驗已經(jīng)證明，Protein A和IgG的相互作用僅涉及Fc區(qū)域，而不影響Fab片段和抗原的結(jié)合。蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白AG純化磁珠見如下頁面：
http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/7094213318.html
2. 融合標(biāo)簽的去除
在通過親和力分離純化目的蛋白后，如果標(biāo)簽的存在將顯著影響其生物功能或適用該蛋白的安全性，則需要能夠移除這些標(biāo)簽，并且這一操作通常時有必要的。許多策略被設(shè)計用來在純化后去除標(biāo)簽。
常用的標(biāo)簽去除方法及其優(yōu)缺點
這種37kDa的絲氨酸蛋白酶被廣泛使用，通過切割LVPR*GS的凝血酶識別序列，從靶蛋白中去除His-tag和其他標(biāo)簽。盡管凝血酶識別的序列是相對特異的，但有報道稱，凝血酶的商業(yè)制備會導(dǎo)致非特異性酶切。凝血酶比其他蛋白酶的一個優(yōu)點是，它能夠在多種表面活性劑存在下保持高活性。因此，凝血酶可用于純化膜蛋白。
2.2 TEV蛋白酶TEV蛋白酶是在煙草蝕刻病毒中發(fā)現(xiàn)的一種酶的27kDa的C端催化亞單位。它對序列ENLYFQ*S.具有高度特異性。最初發(fā)現(xiàn)經(jīng)過長時間的培養(yǎng)，該蛋白酶會自我消化。然而，通過對其進(jìn)行各種突變修改，已可以作為去除標(biāo)簽的工具。研究發(fā)現(xiàn)，S219V突變使其蛋白水解酶活性增加了至少兩倍，同時也降低了自身降解的敏感性。此外，缺乏C端238-242殘基的蛋白酶變體具有更高的表達(dá)量和催化活性。TEV蛋白酶的主要缺點是與其他蛋白酶相比轉(zhuǎn)化率較低。其較低的轉(zhuǎn)化率可能解釋了其對識別序列的高度特異性，但導(dǎo)致消化時間長和消化所需的蛋白酶量較高。然而一個優(yōu)勢是，識別序列中的絲氨酸可以轉(zhuǎn)變成蛋氨酸，在酶切后能產(chǎn)生一個“天然”的N末端。由于TEV蛋白酶切位點的廣泛性和低成本，也是大規(guī)模純化中很好的選擇。
3C蛋白酶是一種來源于人鼻病毒的48kDa大小的重組半胱氨酸蛋白酶。與TEV蛋白酶一樣，它對其識別序列LEVLFQ*GP具有高度特異性。3C蛋白酶也被設(shè)計成含有一個親和標(biāo)簽，它有助于在裂解后將其從純化蛋白溶液中去除。主要缺點是酶切后不能目的蛋白不能形成天然N末端。另一方面，與TEV蛋白酶相比，3C蛋白酶在4攝氏度下有10倍以上的活性。
2.4 內(nèi)蛋白介導(dǎo)的自剪切內(nèi)蛋白在細(xì)菌和酵母菌中發(fā)現(xiàn)的能夠自我切除的蛋白質(zhì)，并且已經(jīng)被改進(jìn)成為能夠在N末端或C末端進(jìn)行剪切以達(dá)到目的蛋白標(biāo)簽去除的目的。例如來自結(jié)核分枝桿菌的微小內(nèi)肽蛋白I-CM突變體已被設(shè)計成有利于C末端剪切。當(dāng)pH值變成6時，C端到I-CM蛋白的序列將被剪切。如果將一個親和標(biāo)簽融合在內(nèi)蛋白的N端，目的蛋白在C端，則可在一定條件下實現(xiàn)無標(biāo)簽蛋白的純化。該系統(tǒng)的優(yōu)點是不需要使用蛋白酶來切割親和標(biāo)簽。缺點是必須將蛋白分成兩部分進(jìn)行純化，以便于純化后的反式剪切，并且可能留有額外的氨基酸殘基。此外在室溫下完全剪切需要比蛋白酶剪切更長的時間。由于用于蛋白質(zhì)純化的內(nèi)蛋白種類繁多，目前還沒有一個可以應(yīng)用于各種不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)或通用方案。
2.5 小泛素相關(guān)修飾劑（SUMO）用于蛋白質(zhì)純化的最常見的SUMO蛋白酶是Ulp1，一種27kDa的酵母酶，能夠?qū)?/span>SUMO部分從靶蛋白中去除。與其他識別線性氨基酸序列的蛋白酶不同，SUMO蛋白酶識別其底物的三級結(jié)構(gòu)，因此具有高度特異性。SUMO底物是一個通常在目的蛋白N端加入的用于提高其溶解性和表達(dá)的10kDa的蛋白，與MBP水平相當(dāng)。與其他蛋白酶相比，它的一個主要優(yōu)勢是在2M尿素和高鹽濃度的條件下依然具有較高的酶切活性。SUMO純化系統(tǒng)是一個具有高溶解性、高位點酶切特異性、能產(chǎn)生天然N末端等優(yōu)勢的可靠的蛋白質(zhì)表達(dá)與純化平臺。但缺點是成本相對較高。
3. 常用于穩(wěn)定蛋白的添加劑
| 類型 | 功能 | 常用試劑 |
| 還原劑 | 防止氧化 | BME |
| DTT | ||
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine(TCEP) | ||
| 蛋白酶抑制劑 | 防止內(nèi)源性蛋白酶分解蛋白 | 亮抑肽酶（絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制劑） |
| 抑胃肽（天冬氨酸蛋白酶抑制劑） | ||
| PMSF（絲氨酸蛋白酶抑制劑） | ||
| 金屬鰲合劑 | 是金屬蛋白酶失活 | EDTA、EGTA |
| 精氨酸激酶 | 穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)溶解性 | 丙三醇 |
| 去污劑（如CHAPS、NP-40、Triton X-100） | ||
| 糖（如葡萄糖、蔗糖等） | ||
| 離子穩(wěn)定劑 | 增強(qiáng)溶解性 | 鹽類如Nacl、kCI、（NH4）） |
4. 總結(jié)
回顧過去幾十年為表達(dá)和純化重組蛋白而開發(fā)的親和標(biāo)簽的發(fā)展趨勢，為了提高純化效率，已經(jīng)向使用IMAC進(jìn)行了重大轉(zhuǎn)移。從2000年起，由于免疫親和樹脂的持續(xù)高成本以及其他純化系統(tǒng)的改進(jìn)，使用表位標(biāo)簽的研究已經(jīng)大幅減少。但在需要載體蛋白促進(jìn)適當(dāng)折疊、增加溶解性和提高表達(dá)水平的應(yīng)用中，這些標(biāo)簽的使用仍然是有價值的，有時是必要的?？紤]到這一需要，在選擇蛋白質(zhì)純化的親和標(biāo)簽和去除標(biāo)簽的工具方面有了許多不同的方法。在過去15年中，載體蛋白與高親和力結(jié)合的IMAC標(biāo)簽的結(jié)合使用有了越來越多的趨勢。未來的趨勢是使用與高可溶性載體蛋白的N端融合的小分子的親和力標(biāo)簽，促進(jìn)目的蛋白的折疊、溶解、表達(dá)和純化，并進(jìn)行柱上的純化及酶切位點的去除。
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