qPCR檢測中極低濃度樣本取樣和隨機誤差對結果的影響分析
2017-7-31 16:19:12點擊：
背景介紹
無論在化學檢驗還是醫(yī)學檢驗中，極低濃度樣本檢測均極為困難，檢測精度的進步是隨著人類對少量、微量、痕量物質(zhì)檢測的要求而一步步提升起來的?；氐结t(yī)學檢測領域，被測物質(zhì)的低值檢測能力一直是衡量產(chǎn)品質(zhì)量的一個最關鍵的指標，但在信號放大和檢測方法沒有革命性改變的情況下，極低濃度樣本的測定是否存在一個偏差上限呢？如果僅僅考慮取樣隨機誤差，結果會受多大的影響？本文將試圖通過建設一個取樣模型進行分析，歡迎業(yè)內(nèi)專家們批評指正，拋磚引玉歡迎大家提出更多更符合實際情況的取樣模型。
實驗過程
假設現(xiàn)采用qPCR檢測試劑盒對已明確定值為50IU/ml乙型肝炎病毒血清樣本進行定量測定，取血清樣200μl，核酸提取富集為50μl，其中20μl用做模板上機進行測定，最終根據(jù)標準曲線計算出濃度值；
20個重復記為一組，對濃度值取對數(shù)后計算均值、CV；
注意，因?qū)嶒災Ｐ驮O置僅考慮取樣誤差，固認為實驗過程完美，不考慮以下可能性誤差：
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操作過程
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樣本濃度偏差
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DNA在樣本中均勻分布，不考慮泊松分布情況
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各品牌對病毒核酸IU單位和拷貝單位的換算關系差異
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IU與拷貝換算關系定為1:1
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試劑儲存及使用
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標準品制備
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核酸提取損耗
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加樣體積準確性
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核酸擴增效率
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熒光閾值調(diào)整
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標品定值曲線擬合度
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其他可能引起結果定值偏差的情況
取樣模型
前提：
濃度為50IU/ml的血清準確量取200μl，其中包含的DNA拷貝數(shù)量為10；
提取富集后的核酸溶液體積為50μl；
取樣體積20μl；
取樣模型描述：
假設將提取富集后的核酸溶液分割為1000個箱子（編號為1,2,3,……,1000）；
其中編號為100倍數(shù)的箱子內(nèi)包含DNA片段（編號為100,200,300,……，1000）；
從1000個箱子中隨機抽樣400份，記錄箱子編號，統(tǒng)計編號為100倍數(shù)的箱子數(shù)量（即為抽到的DNA數(shù)量，期望值為4，對應濃度值為50IU/ml，取對數(shù)為1.69897）；
隨機取樣20次，得到20次抽取DNA數(shù)量的記錄，計算得到一組濃度對數(shù)均值和CV；
如取樣中未取到DNA，則對剩余的有效記錄計算均值和CV；
數(shù)據(jù)結果及分析：
計算獲得1萬組數(shù)據(jù)，將濃度對數(shù)均值和CV從大到小按照等距分為100組，用柱形圖對濃度對數(shù)均值和CV頻次進行分析。
綜上，僅考慮取樣時的隨機誤差時，濃度50IU/ml樣本實驗結果統(tǒng)計如下：
同等條件下，如果樣本更換為100IU/ml，隨機抽樣結果如下：
結論：
隨著方法學的不斷成熟，很多以前不能檢測的微量甚至痕量樣本都可以進行測定，但每種方法學都有自己的檢測閾值下限，理論上是不可能突破方法學和實際操作流程限制來人為拔高檢測精度的。
隨機抽樣和筆者實際實驗表明用qPCR方法對極低值樣本(≤100IU/ml)進行檢測定值是個極為困難的事情，實驗CV能控制在5%以內(nèi)幾乎不可能。不知道其他實驗室或研發(fā)人員是否有精度控制的獨門絕招可以大幅降低實驗偏差。
我們希望能看到更多更好的產(chǎn)品出現(xiàn)，客觀公正得對產(chǎn)品進行性能評估，也希望有更劃時代的方法學出現(xiàn)，讓我們的醫(yī)學檢測更加精準，為患者的早篩查、早診斷、早治療做出貢獻。
參考資料:
核酸擴增法檢測試劑注冊技術審查指導原則
YY/T 1182-2010核酸擴增檢測用試劑(盒)
關于HBV-DNA及HBsAg定量單位IU/ml、copies/ml和ng/ml之間的換算問題
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