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摘要：納米粒子作為一種新型的材料，在食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。納米粒子在生物環(huán)境中會(huì)自發(fā)地吸附蛋白質(zhì)，數(shù)十甚至幾百種蛋白質(zhì)在納米粒子表面會(huì)形成蛋白冠。而蛋白冠在納米粒子表面的形成則是影響其穩(wěn)定性、生物相容性、靶向性以及藥物釋放性能的重要因素之一。蛋白冠的形成機(jī)制受到多種因素的影響，如納米粒子的尺寸、形狀、表面化學(xué)性質(zhì)等。同時(shí)，蛋白質(zhì)的種類、濃度、pH等也會(huì)對(duì)蛋白冠的形成產(chǎn)生影響。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其在納米粒子表面的分布密切相關(guān)，而蛋白質(zhì)的構(gòu)象則會(huì)影響其在納米粒子表面的結(jié)合方式和穩(wěn)定性。蛋白冠在納米粒子表面形成的機(jī)制和影響因素十分復(fù)雜，需要綜合考慮多個(gè)因素的作用。了解蛋白冠的形成機(jī)制和影響因素會(huì)幫助我們理解蛋白冠的形成過程并針對(duì)特定需求來控制特定蛋白冠的形成。本文綜述了近年來對(duì)蛋白冠在納米粒子表面形成機(jī)制和影響因素的研究，以期為蛋白冠的深入研究提供理論依據(jù)。

納米粒子(nanoparticles, NPs)是至少在一個(gè)維度上尺寸小于100 nm的顆粒。NPs具有尺寸小和表面體積比高的特點(diǎn)，因此其具有良好的化學(xué)、電子、光學(xué)、磁性和機(jī)械性能^[1]。由于NPs具有獨(dú)特的物理和化學(xué)特性，已被廣泛用于催化、電子學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和食品領(lǐng)域^[2]。在生物醫(yī)學(xué)和食品領(lǐng)域，NPs進(jìn)入人體生物環(huán)境后會(huì)產(chǎn)生各種新的變化，對(duì)NPs表面蛋白質(zhì)吸附的研究是目前的研究熱點(diǎn)。蛋白冠(protein corona, PC)是指納米材料在進(jìn)入生物環(huán)境后(如血液、血清和細(xì)胞質(zhì)等)，其表面吸附的一層或多層蛋白質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)^[3]。PC一般由數(shù)十或數(shù)百種蛋白質(zhì)組成。它們改變了NPs的物理化學(xué)性質(zhì)，如大小、zeta電位、形態(tài)和聚集狀態(tài)。與此同時(shí)，PC還改變了NPs和生物系統(tǒng)之間的相互作用，并參與調(diào)節(jié)NPs的動(dòng)力學(xué)、運(yùn)輸和反應(yīng)途徑^[4]。PC分為兩種類型：松散地與NPs結(jié)合且動(dòng)態(tài)較高、關(guān)聯(lián)較弱的軟冠(soft corona, SC)和與NPs緊密結(jié)合更穩(wěn)定、交換更緩慢的硬冠(hard corona, HC)^[5]。隨著時(shí)間的推移，先形成的SC所含蛋白質(zhì)會(huì)被親和力更高的蛋白質(zhì)所取代從而形成HC。PC的形成不僅受到環(huán)境中pH、時(shí)間、溫度、蛋白組成、濃度和狀態(tài)的影響，還受到NPs尺寸、形狀和表面化學(xué)性質(zhì)等特征的影響^[6]。所有這些因素都是相互關(guān)聯(lián)的，每個(gè)單獨(dú)的因素都對(duì)PC的組成產(chǎn)生重要影響。因此，理解PC在NPs表面形成機(jī)制和影響因素已成為納米材料研究的重點(diǎn)。認(rèn)知NP的形成機(jī)制與影響因素可以幫助我們了解PC的形成，確定不同因素發(fā)揮的作用，以便在各種應(yīng)用中調(diào)節(jié)控制PC的形成。納米粒子表面蛋白冠Corona的形成機(jī)制和關(guān)鍵影響因素分析，purimag Promix kit系列磁珠在血清血漿蛋白組學(xué)研究中具有重要意義（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質(zhì)組學(xué)-生物磁珠專家）。

1  蛋白冠的形成機(jī)制及研究方法

PC的形成是一個(gè)伴隨著Vroman效應(yīng)的平衡過程，這種效應(yīng)是指豐度較高的蛋白質(zhì)首先到達(dá)并黏附在NPs的表面形成動(dòng)態(tài)實(shí)體，然后被親和力較高的蛋白質(zhì)取代，在多蛋白質(zhì)系統(tǒng)中形成穩(wěn)定的實(shí)體^[7]。Vroman效應(yīng)是一個(gè)常見的現(xiàn)象，其中復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物競爭NPs的有限的表面位點(diǎn)，一個(gè)蛋白質(zhì)可能會(huì)解吸或留下一個(gè)表面空位被其他蛋白質(zhì)迅速填補(bǔ)。PC在NP表面形成的納米生物界面取決于原始NP的性質(zhì)和環(huán)境因素，而環(huán)境控制著細(xì)胞對(duì)NPs的識(shí)別^[8]。在生物環(huán)境中，由于常見的且結(jié)合不緊密的蛋白質(zhì)和那些不常見的卻結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)之間存在競爭關(guān)系，PC成分會(huì)隨著時(shí)間變化而達(dá)到平衡。Nastyshyn等^[9]通過研究發(fā)現(xiàn)在血液中形成的蛋白冠其早期吸附的成分和吸附量與晚期的不完全相同，其中，SC中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)蛋白質(zhì)仍存在于HC中。高豐度和結(jié)合速度快的蛋白質(zhì)會(huì)在幾秒鐘到幾分鐘內(nèi)形成初始PC或SC，后期則被具有更高親和力的蛋白質(zhì)取代形成HC，這個(gè)取代過程甚至可以達(dá)到幾小時(shí)^[10]。HC足夠穩(wěn)定，可以保持其初始狀態(tài)并存在很長時(shí)間，而SC會(huì)動(dòng)態(tài)地與周圍的蛋白質(zhì)交換，并隨著時(shí)間和環(huán)境的變化而變化^[11]。一般來說，HC直接與NPs的表面相互作用，而SC通過弱的蛋白-蛋白相互作用與NPs相互作用^[12]。但HC并不完全覆蓋NPs的表面，這就給低親和力的蛋白質(zhì)提供了直接接觸NPs表面并與NPs上的某些功能團(tuán)相互作用的機(jī)會(huì)^[13]。    同時(shí)，組成PC的蛋白分為軟蛋白和硬蛋白，軟蛋白和硬蛋白的吸附模式明顯不同(圖1)^[14]。由于硬質(zhì)蛋白質(zhì)不容易展開，它們的疏水結(jié)構(gòu)域傾向于內(nèi)部折疊，其親水性結(jié)構(gòu)域分布在外部。硬蛋白的吸附主要由靜電相互作用驅(qū)動(dòng)，并可能采取特定的取向，因此只有在靜電相互作用有利時(shí)才會(huì)吸附到親水表面^[15]。一般來說，硬蛋白比軟蛋白更難吸附在疏水表面上。與硬蛋白相比，軟蛋白在結(jié)構(gòu)上不太穩(wěn)定，其吸附過程涉及多種驅(qū)動(dòng)力，吸附過程更難預(yù)測^[16]。目前對(duì)PC動(dòng)態(tài)過程的研究大多集中在PC的構(gòu)象、組成和其他隨時(shí)間變化的表面特性上^[17]。由于蛋白質(zhì)本身的復(fù)雜性和多樣性，只有大約20種蛋白質(zhì)被明確歸類為“軟”或“硬”。大多數(shù)蛋白質(zhì)，如葡萄糖氧化酶或脂肪酶，尚未被分配到特定類別，需要通過更多的實(shí)驗(yàn)來確定特定的蛋白質(zhì)吸附行為。purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質(zhì)組學(xué)-生物磁珠專家）。

圖1  硬蛋白和軟蛋白的吸附差異^[14]         

1.2  蛋白冠的研究方法

對(duì)PC的現(xiàn)有研究方法如圖2所示，主要分為直接方法和間接方法^[18]。直接方法主要包括使用各種技術(shù)直接分析吸附在NPs表面的蛋白質(zhì)，如透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)、凝膠電泳(gel electrophoresis, GE)、質(zhì)譜法(mass spectrometry, MS)和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)等。這些方法提供了關(guān)于吸附蛋白質(zhì)特性和數(shù)量的信息，但通常需要從過量的蛋白質(zhì)中提純，并且會(huì)對(duì)PC結(jié)構(gòu)造成一定的破壞。在直接方法中，還可以使用圓二色譜(circular dichroism, CD)、傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)和原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)等技術(shù)，用于研究PC的結(jié)構(gòu)變化，但這些方法不能提供關(guān)于蛋白質(zhì)的定量信息。另一方面，間接方法通過測量底層NPs性能的變化來研究PC。這些方法包括測量NPs尺寸的增加，如TEM、AFM、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)、納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)和動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering, DLS)等；NPs在矩陣中的移動(dòng)，如GE、差速離心沉降(differential centrifugal sedimentation, DCS)等；NPs表面電荷的變化，如激光多普勒風(fēng)速測定(laser Doppler anemometry, LDA)、可調(diào)電阻脈沖傳感(tunable resistance pulse sensing, TRPS)和毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)等；NPs的常見性能測定，如熒光相關(guān)光譜(fluorescence correlation spectroscopy, FCS)、紫外可見吸收光譜(ultraviolet- visible absorption spectroscopy, UV-Vis)、等溫滴定量熱法(isothermal titrimetric calorimetry, ITC)、石英晶體微天平(quartz crystal microbalance, QCM)和懸浮微通道諧振器(suspend microchannel resonator, SMR)的測量等。              

圖2  PC現(xiàn)有研究方法^[18]          

這些方法可以從不同角度深入研究PC的形成，探討NPs和蛋白質(zhì)之間的相互作用。通過直接方法，能夠深入了解吸附蛋白質(zhì)的特性和數(shù)量，但需要注意結(jié)構(gòu)破壞和提純過程可能導(dǎo)致失去部分信息。而間接方法通過測量底層NPs性能的變化，為我們提供了更全面的了解PC形成的途徑，涵蓋了尺寸變化、表面電荷變化、熒光特性等多個(gè)方面。這些方法的綜合運(yùn)用可以促進(jìn)對(duì)PC形成機(jī)制的深刻理解，為NPs在生物體內(nèi)的應(yīng)用提供有力支持。

2  蛋白冠形成的影響因素

了解影響PC形成的影響因素能夠幫助我們更好地認(rèn)知PC的形成過程，并根據(jù)需求來調(diào)節(jié)PC的特性。影響因素包括：NPs的特性，如尺寸、形狀、濃度、機(jī)械性能和表面化學(xué)性質(zhì)；NPs的孵化環(huán)境條件，如時(shí)間、溫度、pH值和蛋白質(zhì)組成等；NPs與蛋白質(zhì)之間的相互作用力，如疏水作用、靜電作用、范德華力、氫鍵和π?π作用。一般來說，PC的形成是NPs、蛋白質(zhì)分子和外部條件的綜合因素的結(jié)果，需要進(jìn)行定性和定量分析來確定與蛋白質(zhì)和NPs之間的相互作用有關(guān)的主要因素，從而為理解PC的形成提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質(zhì)組學(xué)-生物磁珠專家）。

2.1  納米粒子特性對(duì)蛋白冠形成的影響

2.1.1  納米粒子的尺寸對(duì)蛋白冠形成的影響

首先，NPs的大小決定了表面曲率、空間位阻和可用于蛋白質(zhì)結(jié)合的表面積，從而影響蛋白質(zhì)的吸附量。NPs的尺寸對(duì)PC的形成有很大程度的影響，蛋白質(zhì)的吸附會(huì)隨NPs的尺寸變化而發(fā)生改變。Abdelkhaliq等^[19]通過液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法得到50 nm與200 nm聚苯乙烯納米粒子(polystyrene nanoparticles, PS NPs)的蛋白質(zhì)單位面積吸附比為1:1.2?1:2.0；結(jié)果表明，尺寸更大的NPs具有更大的表面積，導(dǎo)致空間位阻和表面曲率更小，為蛋白質(zhì)提供了更合適的結(jié)合位點(diǎn)。Marichal等^[20]使用不同尺寸的二氧化硅納米粒子(SiO₂ nanoparticles, SiO₂NPs)與可溶性酵母蛋白提取物相互作用，以吸附等溫線作為指標(biāo)發(fā)現(xiàn)尺寸大的NPs在單位表面上吸附了更多的蛋白質(zhì)。Kihara等^[21]通過蛋白質(zhì)的吸附動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)顆粒尺寸越小，動(dòng)力學(xué)演變?cè)娇烨业鞍踪|(zhì)層越薄。不同種類NPs的尺寸效應(yīng)也會(huì)對(duì)蛋白吸附量產(chǎn)生不同的影響。Huber等^[22]研究了CeO₂和TiO₂NPs在不同介質(zhì)和條件下的蛋白吸附量，結(jié)果表明當(dāng)NPs粒徑小于25 nm時(shí)，具有最大的表面積/質(zhì)量比，吸附的蛋白數(shù)量最多。Partikel等^[23]通過考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)測定法來量化聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA]基NPs堿水解后的總吸附蛋白質(zhì)量，結(jié)果表明在100?200 nm范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)在PLGA-NP和聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid)-polyethylene glycol, PLGA-PEG]基NPs上的吸附并不取決于NPs的大小。    

此外，NPs的大小也會(huì)影響PC的類型和組成。Zhao等^[24]使用聚丙烯酰胺凝膠電泳和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法確定了血液中銀納米粒子(Ag nanoparticles, AgNPs)的主要結(jié)合蛋白為人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)，通過表面積和濃度來研究AgNPs曲率對(duì)形成PC的影響；結(jié)果表明AgNPs與半胱氨酸和胱氨酸相互作用，破壞了HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)與空間構(gòu)象，而且這種作用在尺寸小的AgNPs上比大的AgNPs更強(qiáng)。PC顯著減輕了AgNPs的毒性并減少了AgNPs的細(xì)胞內(nèi)化，在相同的面積濃度下，較大的顆粒會(huì)有更明顯的抑制作用。NPs的尺寸還會(huì)對(duì)PC的形態(tài)和結(jié)合位置造成影響。Sajib等^[25]采用了分子動(dòng)力學(xué)模擬來研究不同尺寸金納米粒子(Au nanoparticles, AuNPs)上的卵磷脂和溶菌酶PC。MD結(jié)果表明PC結(jié)構(gòu)取決于蛋白質(zhì)類型和NPs的大小。NPs尺寸的減少會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)吸附方向的角度自由度增加，與溶菌酶在AuNPs表面的不均勻多層聚集相比，卵磷脂蛋白形成均勻的單層吸附(圖3)。2.1.2  納米粒子的形狀對(duì)蛋白冠形成的影響NPs的形狀對(duì)吸附在NPs表面的蛋白質(zhì)的數(shù)量和類型有很大影響。Visalakshan等^[26]制備了兩種性質(zhì)相同的球體和棒狀介孔SiO₂NPs。研究結(jié)果表明，在血漿和血清中附著在棒狀SiO₂NPs上的蛋白質(zhì)數(shù)量遠(yuǎn)高于球狀SiO₂NPs。SiO₂NPs對(duì)白蛋白、纖維蛋白原和免疫球蛋白的吸附存在形狀依賴性差異，NPs的形狀是免疫系統(tǒng)用于識(shí)別和清除外來實(shí)體的特定蛋白質(zhì)的關(guān)鍵因素。Kuschnerus等^[27]采用散射、成像和蛋白質(zhì)表征技術(shù)的組合來評(píng)估不同形狀對(duì)SiO₂NPs表面PC的影響。結(jié)果表明，特定的蛋白質(zhì)吸附概況高度依賴于暴露的面積和長寬比。如圖4所示，球形NPs (AMS-6S)形成相對(duì)均勻的SC和HC且白蛋白含量較高，而棒狀NPs (SBA-15)和刻面狀NPs (AMS-6F)擁有與外表面結(jié)合較弱的SC，并在更大程度上受到顆粒形態(tài)的影響。Bewersdorff等^[28]使用了4種不同形狀(球體、棒狀、星狀和籠狀)的AuNPs在人血清中進(jìn)行孵化，通過液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)，并比較其相對(duì)豐度。圖5所示的結(jié)果表明AuNPs的形狀比表面電荷具有更大的影響。特別是籠狀的AuNPs顯示出較低的總蛋白量，與其他形狀相比，納米籠可以提供更好的生物相容性，因?yàn)楦咔蕝^(qū)域和平面上的密集連接可能會(huì)阻礙免疫系統(tǒng)的滲透和清除。              

圖3  卵磷脂蛋白與溶菌酶AuNPs表面形成PC的對(duì)比^[25]         

2.1.3  納米粒子的表面化學(xué)性質(zhì)對(duì)蛋白冠形成的影響

NPs的表面電荷和疏水特性可以通過不同的表面化學(xué)修飾來改變，從而反過來影響PC的類型和NPs吸附蛋白質(zhì)的數(shù)量。一般來說，蛋白質(zhì)同時(shí)具有疏水性和親水性結(jié)構(gòu)，在納米材料存在的情況下，這些結(jié)構(gòu)可以在空間上重新排列，以最大限度地?cái)U(kuò)大與納米材料表面的相互作用，從而具有更強(qiáng)的疏水性或親水性^[29]。PC可以顯著改變NPs在體內(nèi)的行為，減少PC形成的主要方法之一是用親水配體和涂層對(duì)顆粒進(jìn)行功能化。親水功能化促進(jìn)了NPs水化殼的形成，從而使NPs表面與蛋白質(zhì)和其他生物分子的相互作用減少^[30]。Lu等^[31]通過熒光強(qiáng)度研究了納米材料(石墨烯和金)的表面親水性是否以及如何影響它們與蛋白質(zhì)的相互作用；結(jié)果表明由于羥基的存在減少了HSA和免疫球蛋白E的吸附，而載脂蛋白E (apolipoprotein E, ApoE)傾向于與所有類型材料發(fā)生類似的相互作用。Yu等^[32]研究發(fā)現(xiàn)隨著NPs疏水性的增加，NPs表面的疏水性相互作用增強(qiáng)，可以結(jié)合更多的蛋白質(zhì)；通過定量分析證明疏水性NPs表面吸附的蛋白質(zhì)高達(dá)親水性NPs的2.1倍；同時(shí)蛋白的結(jié)合量也與蛋白類型有關(guān)，如血紅蛋白胎兒亞基β和血清白蛋白與疏水NPs結(jié)合率更高，而體外結(jié)合蛋白和抗凝血酶Ⅲ更容易與親水NPs結(jié)合，親水性NPs表現(xiàn)出比疏水性NPs更高的HC蛋白交換率。 

圖4  不同形狀SiO₂NPs吸附PC差異^[27]          

圖5  四種不同形狀AuNPs及其乳清蛋白冠豐度對(duì)比^[28]          

使用不同的涂層材料，如表面活性劑或聚電解質(zhì)，可以很容易地調(diào)整NPs的表面化學(xué)性質(zhì)。聚電解質(zhì)涂層由于電荷密度高，可以穩(wěn)定NPs的分散體。一般來說，聚合物通常對(duì)非特異性蛋白質(zhì)的吸附較少^[33]。但Gr?fe等^[34]通過特定的蛋白免疫印記檢測，在聚氫丙氨酸涂層的多孔氧化鐵NPs上檢測到白蛋白的吸附量增加，而一些嵌段共聚物穩(wěn)定的NPs即使親水鏈較短，仍然表現(xiàn)出了突出的蛋白質(zhì)排斥特性^[35]。Weiss等^[36]發(fā)現(xiàn)在聚合物表面的涂層阻止了參與形成HC的蛋白質(zhì)在SiO₂NPs上的吸附，從而只形成了SC。González等^[37]通過在納米材料表面復(fù)合羧酸、胺和碳?xì)浠衔锏谋∧碓u(píng)估納米材料表面化學(xué)成分對(duì)血清和血漿中PC形成的影響；研究發(fā)現(xiàn)含有羥基為主的表面化學(xué)成分的NPs導(dǎo)致了富含白蛋白的PC的形成，而富含胺的涂層導(dǎo)致精氨酸酶的吸附增加。Abdelkhaliq等^[19]發(fā)現(xiàn)，在與腸道細(xì)胞結(jié)合時(shí)，PS NPs在用帶負(fù)電荷的砜或羧基進(jìn)行表面修飾后，其表面的蛋白質(zhì)組成是不同的；結(jié)合蛋白、脂蛋白等在顆粒上被富集，而α-2-巨球蛋白、β-2-糖蛋白和血紅蛋白等在砜類功能化PS NPs上的吸收率明顯降低。Kihara等^[21]發(fā)現(xiàn)天然PS NPs可以與HSA形成HC，而當(dāng)NPs被羧酸修飾時(shí)，只能形成SC。在NPs表面修飾鹽類物質(zhì)會(huì)影響PC中蛋白的含量。Delgado等^[38]發(fā)現(xiàn)，羧酸鹽會(huì)使白蛋白更容易流失，而磺酸鹽對(duì)白蛋白的附著力更強(qiáng)，產(chǎn)生持久的HC，具有更好的生物相容性；該機(jī)制認(rèn)為磺酸鹽和胺之間的相互作用能高于羧酸鹽和胺之間的相互作用能。Danner等^[39]研究了通過修飾聚甘油(polyglycerin, PG)逐漸增加負(fù)電荷的PS，當(dāng)磷酸鹽含量較低時(shí)，聚集素蛋白是最主要的蛋白質(zhì)；隨著磷酸鹽含量的增加，聚集素蛋白的比例下降到20%左右；此外纖維蛋白原(fibrinogen, Fb)特別是免疫球蛋白成分也同時(shí)增加。磷酸鹽的引入不僅使蛋白質(zhì)的絕對(duì)吸附能力大大增加，而且使蛋白質(zhì)的特異性大大降低。纖維蛋白原和免疫球蛋白隨著磷酸鹽基團(tuán)的增加而富集。Martens等^[40]研究表明，檸檬酸鹽和葡聚糖很容易被Fb取代，纖維蛋白原與表面結(jié)合后可以穩(wěn)定磁性NPs，使其不會(huì)隨時(shí)間的推移而聚集；PEG涂層通過作為Fb在NPs表面吸附的屏障增加了磁性NPs的穩(wěn)定性，并使Fb共軛物與含有整合素的膜呈現(xiàn)出更高的結(jié)合。   

2.1.4  納米粒子的組成成分、濃度與機(jī)械性能對(duì)蛋白吸附能力的影響

NP的組成成分是決定與NPs結(jié)合的蛋白質(zhì)的親和力和特性的關(guān)鍵因素。Deng等^[41]研究了人血漿蛋白與具有相同表面電荷金屬氧化物NPs (TiO₂、SiO₂和ZnO)的結(jié)合發(fā)現(xiàn)，相似的蛋白質(zhì)吸附在TiO₂NPs和SiO₂NPs上，而構(gòu)成ZnO PC的蛋白質(zhì)卻截然不同。在TiO₂NPs和SiO₂NPs的PC中檢測到了簇蛋白、載脂蛋白D和α-2-酸性糖蛋白，而在ZnO的PC中未觀察到這些；而一些其他蛋白質(zhì)，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、免疫球蛋白重鏈α和結(jié)合珠蛋白α僅在ZnO的PC中發(fā)現(xiàn)。Monopoli等^[42]研究SiO₂NPs和PS NPs發(fā)現(xiàn)，隨著血漿濃度的增加，PS NPs吸附的蛋白質(zhì)總量顯著增加，特別是纖維蛋白原和免疫球蛋白的量增加，最初主要與HSA相關(guān)，最終與載脂蛋白和補(bǔ)體蛋白一起減少；隨著血漿濃度的增加，雖然SiO₂NPs吸附的蛋白質(zhì)總量略有下降，纖維蛋白原下降約10%，但富含組氨酸的糖蛋白、纖溶酶原、HSA、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒蛋白和β-糖蛋白等蛋白質(zhì)被富集。Akhtar等^[43]研究了Fe₃O₄磁性納米粒子(Fe₃O₄ magnetic nanoparticles, MNPs)和涂有迷迭香酸的Fe₃O₄磁性納米粒子(Fe₃O₄@rosmarinic acid, Fe₃O₄@RA MNPs)對(duì)蛋清溶菌酶(egg white lysozyme, EWL)的穩(wěn)定性和活性的影響；熒光分析結(jié)果表明，兩種MNPs都可以對(duì)EWL的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生兩種相反的影響，在低于閾值濃度時(shí)它們改善了EWL的結(jié)構(gòu)，在高于該濃度時(shí)它們逐漸導(dǎo)致其降解；在與兩種MNPs相互作用后，EWL的螺旋度增加，與純RA相互作用后螺旋度下降。如圖6所示，Hui等^[44]研究了NPs剛度(700 kPa?10 GPa)對(duì)PC形成的影響，結(jié)果表明剛度最高的納米膠囊表面PC含有最多的補(bǔ)體蛋白和免疫球蛋白，證實(shí)了NPs剛度在控制PC形成方面具有重要作用。              

圖6  四種剛度硅納米膠囊對(duì)PC形成的影響^[44]          

綜上所述，NPs的物理化學(xué)特性會(huì)對(duì)PC的形成產(chǎn)生多方面的影響：NPs的尺寸、形狀和機(jī)械性能等都會(huì)對(duì)PC產(chǎn)生不同的影響，需要更多的工作來驗(yàn)證NPs的物理特性如何影響NPs上吸收的蛋白質(zhì)的含量、類型和方向。選擇NPs的大小、形狀時(shí)還應(yīng)考慮制備的工藝、時(shí)間和成本。NPs不同的形狀會(huì)影響它們與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力，復(fù)雜的結(jié)構(gòu)外觀可能會(huì)阻礙NPs與蛋白的相互作用。NPs的化學(xué)特性明顯影響吸附蛋白質(zhì)的類型和含量，且化學(xué)特性相較物理特性更容易改變。NPs的表面化學(xué)性質(zhì)對(duì)原PC形成的影響是非常復(fù)雜的，很難得出一般性的結(jié)論。選擇NPs時(shí)需注意NPs可能會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生的毒性，盡量選擇毒性較弱、便于代謝的NPs。若需對(duì)NPs進(jìn)行化學(xué)改性，應(yīng)選擇無毒的化學(xué)材料防止對(duì)生物造成負(fù)面影響。同時(shí)，不同種類NPs的特性對(duì)PC形成也會(huì)產(chǎn)生影響，在保持其他因素固定的情況下也應(yīng)考慮NPs種類對(duì)蛋白質(zhì)吸附能力的影響。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)還要考慮NPs濃度對(duì)PC形成的影響，過高濃度的NPs會(huì)發(fā)生聚集，而濃度較低則無法比較NPs對(duì)蛋白的吸附能力。實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)涉及以上幾種因素同時(shí)影響PC的形成，因此研究這些因素的協(xié)同相互作用也將是未來實(shí)驗(yàn)中的重要方向，通過調(diào)節(jié)NPs的物理化學(xué)特性從而達(dá)到形成特定PC的目的。              

2.2  環(huán)境因素對(duì)蛋白冠形成的影響

2.2.1  pH對(duì)蛋白冠形成的影響水溶液的酸堿度可以影響

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)與NPs間的親和力，從而改變PC的結(jié)合位置。Meesaragandla等^[45]研究發(fā)現(xiàn)HSA作為血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，其構(gòu)象變化依賴于pH的改變。pH值還會(huì)通過氫鍵影響PC的穩(wěn)定性和PC中蛋白質(zhì)的折疊^[46]。Sanchez-Guzman等^[47]發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值為7.0和9.0時(shí)，血紅蛋白在NPs表面分別形成HC和SC，從而推斷極性和帶電氨基酸的暴露可能推動(dòng)了血紅蛋白和NPs之間的相互作用。Huber等^[22]研究了pH對(duì)蛋白質(zhì)和NPs之間穩(wěn)定性的影響。在pH值為3.5和10.0時(shí)，沒有測量到明顯的相互作用，而在pH為5.1和6.0時(shí)，牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)在NPs表面有強(qiáng)烈的吸附，形成穩(wěn)定的HC，導(dǎo)致電荷反轉(zhuǎn)。Givens等^[48]研究了模型BSA與兩種不同的金屬氧化物TiO₂NPs和SiO₂NPs在生理和酸性pH下的相互作用。通過使用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜和熱重分析測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)吸附的pH和NPs依賴性差異。結(jié)果如圖7所示，BSA在TiO₂NPs和SiO₂NPs表面的覆蓋率隨著pH的降低而降低，在酸性pH下，BSA在TiO₂NPs上完全展開，而在SiO₂NPs上呈現(xiàn)延伸構(gòu)象。    

pH對(duì)蛋白質(zhì)與NPs結(jié)合的相互作用力也有很大影響。Wang等^[49]研究了固體脂質(zhì)NPs (solid lipid nanoparticles, SLN)和BSA之間的相互作用，以探索顆粒大小和pH值對(duì)BSA PC形成的影響。BSA吸附是由多種力驅(qū)動(dòng)的，pH為7.4時(shí)主要相互作用為范德華力和氫鍵，而pH為6.0時(shí)為靜電吸引力；此外，由于靜電排斥減弱，PC引起的聚集發(fā)生在pH 6.0時(shí)，而在pH 7.4中沒有出現(xiàn)聚集的跡象；PC形成后，BSA構(gòu)象發(fā)生變化，包括氨基酸殘基的暴露或隱藏以及α-螺旋含量的增加。NPs可以在一定的pH值范圍內(nèi)吸收蛋白質(zhì)，這取決于其等電點(diǎn)。pH值越接近等電點(diǎn)，吸收蛋白質(zhì)的能力就越強(qiáng)。Shan等^[50]檢測了pH 2.0?11.0對(duì)TiO₂NPs周圍形成的乳清PC的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)的影響；結(jié)果表明溶液的pH值影響乳清蛋白分子的結(jié)構(gòu)，乳清蛋白在等電點(diǎn)的吸附能力最大，在高酸性或堿性條件下吸附能力最低。Davidov等^[51]研究了AgNPs的SC中BSA分子在不同pH值下的配合物的締合常數(shù)(Kas)和BSA熒光猝滅的雙分子速率常數(shù)(Kq)；結(jié)果表明pH對(duì)Kas和Kq的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在pH 6.0時(shí)最大；結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量和BSA的SC厚度在pH 6.0時(shí)也是最大的，而在較高和較低的pH值下降低。purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質(zhì)組學(xué)-生物磁珠專家）。

圖7  不同pH對(duì)TiO₂NPs PC和SiO₂NPs PC形成的影響^[48]          

2.2.2  時(shí)間和溫度對(duì)蛋白冠形成的影響

由于蛋白質(zhì)在NPs上的吸附和解吸在生理環(huán)境中是高度動(dòng)態(tài)的，NPs在顆粒上吸附的原蛋白的質(zhì)量和數(shù)量特征都會(huì)隨著孵化時(shí)間和溫度發(fā)生敏感的變化。Palchetti等^[52]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)未改性和聚乙二醇化的脂質(zhì)NPs暴露于胎牛血清時(shí)，孵化時(shí)間可以影響PC的組成，從而對(duì)細(xì)胞攝取產(chǎn)生影響。Li等^[53]根據(jù)形成機(jī)制和時(shí)間的變化，研究了蛋白質(zhì)與PC解離的影響因素；他們發(fā)現(xiàn)溫度和半胱氨酸是通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)合能力來影響蛋白質(zhì)的解離程度；結(jié)果表明形成一半的Au?S鍵的時(shí)間是硫代蛋白解離的重要時(shí)間點(diǎn)；當(dāng)孵化時(shí)間超過該時(shí)間時(shí)，位于HC中的硫代蛋白只能在分析性超離心下通過β-巰基乙醇替換來分離；Au?S鍵形成時(shí)間為定義AuNPs的蛋白質(zhì)富集時(shí)間提供了參考。Mahmoudi等^[54]發(fā)現(xiàn)加熱類型對(duì)PC的組成有顯著影響，光誘導(dǎo)加熱與傳統(tǒng)加熱后的PC組成存在顯著差異；在45 ℃條件下，HC中低分子量蛋白質(zhì)含量更高。Gorshkov等^[55]研究了溫度和pH值對(duì)AgNPs在人類血漿中形成的PC的影響，結(jié)果表明38%的定量蛋白質(zhì)在所有溫度下都會(huì)結(jié)合，47%在所有pH值下都會(huì)結(jié)合；在這些最持久的蛋白質(zhì)中，大約60%在蛋白質(zhì)冠層中的豐度沒有明顯變化。而對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)和對(duì)溫度有抵抗力的蛋白質(zhì)，即使在有限的生理范圍內(nèi)(從37?41 °C)，溫度也會(huì)影響蛋白質(zhì)擴(kuò)散率和對(duì)NPs的親和力。本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，在超聲條件下SiO₂ PC的形成在一定范圍內(nèi)與時(shí)間和溫度呈正相關(guān)，而過高的溫度與長時(shí)間的超聲則會(huì)導(dǎo)致SiO₂ PC中蛋白質(zhì)含量下降，進(jìn)而影響PC的親水性與抗氧化能力^[56]。purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質(zhì)組學(xué)-生物磁珠專家）。

2.2.3  蛋白質(zhì)濃度、組成和狀態(tài)對(duì)蛋白冠形成的影響

蛋白質(zhì)和NPs之間的相互作用受蛋白質(zhì)的濃度、組成和孵化狀態(tài)的影響。蛋白質(zhì)的各種特性，如分子量、氨基酸組成和表面電荷，都是影響蛋白質(zhì)與NPs親和力的決定性因素，這影響了PC中多種成分的含量變化^[57]。首先，孵化介質(zhì)中的蛋白質(zhì)濃度會(huì)影響NPs和蛋白質(zhì)的吸收，導(dǎo)致PC的厚度和穩(wěn)定性的差異^[58]。PC的組成還與血漿或生理液體的種類和來源密切相關(guān)。來自患有不同疾病的人類血漿樣本和來自不同來源的血漿，如人類或其他不同動(dòng)物的血漿，都會(huì)影響PC的組成^[59]。Solorio-Rodríguez等^[60]通過納米液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定功能化的SiO₂NPs在人和小鼠血漿PC狀圖之間的差異；結(jié)果表明在人類PC中發(fā)現(xiàn)的最豐富的蛋白質(zhì)是免疫球蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體C3蛋白和脂蛋白A-1等；同時(shí)，小鼠PC吸附了絲氨酸蛋白酶抑制劑、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、纖維蛋白原γ和β鏈等。不同性別的魚的血漿樣品可以使AgNPs的PC在蛋白質(zhì)多樣性、蛋白質(zhì)成分的相對(duì)比例和特定蛋白質(zhì)標(biāo)記物的數(shù)量上有明顯的差異^[61]；雌性魚血漿中的一些特定蛋白質(zhì)成分，如卵黃素和透明帶，甚至可以引導(dǎo)AgNPs到特定的器官和組織。   

 如果NPs暴露在不同的生物液體中，PC的成分也可能會(huì)大不相同。在一項(xiàng)研究中，Cui   等^[62]評(píng)估了裸脂質(zhì)體、聚乙二醇化脂質(zhì)體和黏蛋白-1主動(dòng)靶向聚乙二醇脂質(zhì)體的PC；一組為在攪拌下與小鼠血清一起孵化以便在體外組裝PC，另一組為直接向小鼠靜脈中注射脂質(zhì)體并在10 min后恢復(fù)血液；在PC組成蛋白質(zhì)的構(gòu)象中發(fā)現(xiàn)了相關(guān)差異，體外PC顯示纖維蛋白含量很高，均勻地覆蓋了表面脂質(zhì)體；而體內(nèi)組裝的PC均勻程度和纖維蛋白含量較低；值得注意的是，體內(nèi)PC的組成更加多樣化，并且比體外條件表現(xiàn)出更多的蛋白質(zhì)。Barbero等^[63]研究了苯酚紅、青霉素-鏈霉素、谷氨酰胺和β-巰基乙醇對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中AuNPs PC形成的影響；在這些條件下，蛋白質(zhì)冠層的形成需要更多的時(shí)間，其密度和組成也發(fā)生了變化。同時(shí)AuNPs的細(xì)胞攝取量隨著NP聚集體的形成而增加。孵化過程中在動(dòng)態(tài)或靜態(tài)狀態(tài)下產(chǎn)生的不同的物理混合效應(yīng)也會(huì)影響PC的形成。PC在接受動(dòng)態(tài)流動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力后可能具有更多的負(fù)電荷^[64]。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，人血漿流動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力會(huì)在AuNPs上形成更復(fù)雜的蛋白層^[65]。Bonvin等^[66]模擬了體內(nèi)血液不同流速下(0.03?30.00 cm/s)體外形成的PC組合物，結(jié)果表明流速的增加會(huì)增加或減少特定蛋白質(zhì)的數(shù)量，且更高的流速的蛋白質(zhì)具有更大的結(jié)構(gòu)靈活性，而一些蛋白質(zhì)對(duì)NPs的親和力較高，不受流速的影響；在微流體環(huán)境中形成的蛋白質(zhì)冠層的相對(duì)蛋白質(zhì)豐度為30%，而在靜態(tài)孵化中生成的蛋白質(zhì)冠層只有26%；剪切力導(dǎo)致PS NPs會(huì)結(jié)合更高濃度的血清蛋白，特別是來自胎牛血清的血漿蛋白。    環(huán)境因素對(duì)PC的影響包括孵化pH、時(shí)間、溫度、蛋白質(zhì)濃度、組成和狀態(tài)等。其中pH、時(shí)間和溫度主要影響了蛋白質(zhì)的活性與空間構(gòu)型，進(jìn)而影響了蛋白配合物的Kas和Kq。由于pH改變了蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，它可以極大地影響蛋白質(zhì)，決定它們的三維結(jié)構(gòu)和整體電荷。pH也會(huì)影響NPs表面電荷和功能基團(tuán)的電離，并最終通過靜電力影響其聚集行為。

蛋白質(zhì)的濃度、組成和狀態(tài)，如搖晃、旋轉(zhuǎn)或液體的流動(dòng)，以及在形成環(huán)境在生物體內(nèi)或體外造成的影響，都需要在PC的分析中發(fā)現(xiàn)和控制。對(duì)于溫度、pH的選擇應(yīng)考慮不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及變性溫度。此外，對(duì)于蛋白質(zhì)來說，其構(gòu)象的靈活性也對(duì)NPs與蛋白質(zhì)的相互作用有很大的影響：與剛性蛋白質(zhì)相比，柔性蛋白質(zhì)通常具有更大的界面和更好的形狀互補(bǔ)性。這些環(huán)境因素不僅影響NPs和生物分子之間的相互作用，而且還會(huì)改變NPs本身的特性，如有效電荷、聚集狀態(tài)等。以上因素的協(xié)同作用尚未被廣泛研究，對(duì)于多種因素的復(fù)合效應(yīng)仍需深入發(fā)掘。此外大多數(shù)關(guān)于PC的研究都集中在體外研究，其結(jié)果不能完全反映PC的影響。NPs的PC成分和結(jié)構(gòu)都會(huì)隨著納米粒子環(huán)境的變化而變化。體外研究不能模擬所有的體內(nèi)參數(shù)，也不能提供一個(gè)完全真實(shí)和動(dòng)態(tài)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。對(duì)于體外研究，應(yīng)選擇生物體內(nèi)含有的蛋白質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)材料，保持模擬的真實(shí)性。若使用非生物自身含有的蛋白質(zhì)，應(yīng)考慮與其他蛋白質(zhì)的相互作用以及是否會(huì)對(duì)生物健康產(chǎn)生影響。不同動(dòng)物體內(nèi)的生物環(huán)境有所差異，對(duì)NPs的研究應(yīng)在不同生物環(huán)境下進(jìn)行驗(yàn)證，以探究普遍規(guī)律。purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質(zhì)組學(xué)-生物磁珠專家）。

2.3  分子間作用力對(duì)蛋白冠形成的影響

分子間作用也稱為非共價(jià)作用，包括疏水作用、靜電作用、范德華力、氫鍵和π?π作用。這些相互作用對(duì)于維持蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)、形狀和功能至關(guān)重要。這些常見的相互作用力也可以在PC的形成過程中觀察到，這些分子間作用力的類型和強(qiáng)度決定了蛋白質(zhì)和NPs之間的親和力，從而影響了動(dòng)力學(xué)反應(yīng)過程。所有這些過程都與熱量的釋放或吸收高度相關(guān)^[67]。主要的結(jié)合力類型仍然可以通過熱力學(xué)參數(shù)推斷出來：當(dāng)ΔH>0和ΔS>0時(shí)，相互作用的主要驅(qū)動(dòng)力是疏水作用；如果ΔH<0和ΔS<0，主要的力是范德華力和氫鍵；如果ΔH<0和ΔS>0，主要作用力是靜電力^[68]。疏水作用被認(rèn)為是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力，對(duì)保持蛋白質(zhì)的構(gòu)象、穩(wěn)定性和生物活性具有重要意義。蛋白質(zhì)可能會(huì)在NPs表面暴露出疏水殘基，一些相對(duì)較大的疏水叔丁基基團(tuán)可以為NPs提供結(jié)合點(diǎn)，并通過疏水作用與之相互作用^[69]。靜電相互作用是指生物大分子和NPs等合作方之間的電荷交換引起的吸引或排斥作用。靜電相互作用對(duì)PC的影響可以歸結(jié)為以下原因。首先是電荷中和效應(yīng)，這是由蛋白質(zhì)中帶正負(fù)電荷的比例引起的，以調(diào)節(jié)與帶負(fù)電的NPs的相互作用。其次是橋接效應(yīng)，這種效應(yīng)產(chǎn)生于反應(yīng)系統(tǒng)中離子強(qiáng)度的增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和NPs之間結(jié)合力的增強(qiáng)，從而促進(jìn)NPs的吸附。最后是特定的受體與配體相互作用，也可能引起強(qiáng)烈的靜電作用。靜電作用比疏水作用稍弱，也是控制蛋白質(zhì)和NPs結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力^[70]。Huang等^[71]提出了蛋白質(zhì)反向電荷奇偶性對(duì)位模型，并演示了負(fù)電荷表面NPs和正電荷表面EWL之間的靜電相互作用。范德華力和氫鍵在PC的形成過程中都很重要，在闡明NPs和蛋白質(zhì)之間的相互作用機(jī)制時(shí)，需要考慮這兩種力的影響。范德華力是蛋白質(zhì)和NPs之間的分子間力，氫鍵主要發(fā)生在NPs的化學(xué)基團(tuán)和蛋白質(zhì)的極性氨基酸之間^[72]。π?π相互作用對(duì)PC的影響程度相較其他作用力較小，主要集中在含芳香族氨基酸的PC中。近年來對(duì)NPs和PC間分子作用力的研究見表1。    

PC的形成和穩(wěn)定性是由多種分子間相互作用力共同作用而決定的。其中，氫鍵和疏水作用被認(rèn)為是對(duì)PC形成影響較大的分子間相互作用力。氫鍵是一種重要的分子間相互作用力，常見于蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基之間。氫鍵可以促進(jìn)亞基之間的相互吸引和穩(wěn)定，進(jìn)而影響PC的形成和穩(wěn)定性。疏水相互作用是指非極性分子之間的相互作用力，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)亞基之間的相互吸引和穩(wěn)定。疏水作用在PC的形成和穩(wěn)定性中也發(fā)揮了重要作用。雖然靜電相互作用、范德華力和π?π相互作用也對(duì)PC的形成和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，但是相對(duì)于氫鍵和疏水相互作用而言，它們的作用相對(duì)較小，只有在特殊情況下作為PC形成的主要作用力，如當(dāng)納米粒子和蛋白質(zhì)的形狀相互補(bǔ)充時(shí)，范德華力通常被認(rèn)為是形成PC的主要作用力；當(dāng)?shù)鞍妆砻婢植侩姾蓮?qiáng)度較高時(shí)，靜電相互作用更顯著；而π?π相互作用為芳香族蛋白質(zhì)的結(jié)合吸附提供了較強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)力。對(duì)于不同種類的分子間作用力在NPs與蛋白質(zhì)形成PC過程所發(fā)揮的作用需要進(jìn)一步研究，針對(duì)不同特殊情況下分別設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并可以通過MD模擬計(jì)算進(jìn)行更高效的驗(yàn)證。             

表1  各種NPs-蛋白質(zhì)系統(tǒng)中影響PC形成主要分子間作用力

3  蛋白冠的預(yù)防措施及利用方法

PC可以增強(qiáng)NPs的生物穩(wěn)定性和相容性，改變NPs與免疫系統(tǒng)的相互作用，影響NPs的細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性。但PC也可能干擾靶向配體與組織特異性受體的相互作用，從而影響藥物遞送效率。此外，蛋白冠還可能影響納米材料在體內(nèi)的分布和代謝。近年來為避免和改善PC帶來的影響，學(xué)者們使用特定抗體或配體進(jìn)行功能化、預(yù)先涂覆功能蛋白質(zhì)、修飾官能團(tuán)吸引特定蛋白質(zhì)以及利用特殊蛋白冠來增強(qiáng)納米粒子的遞送效果。為了防止PC的形成，常用的方法是通過接枝親水聚合物(例如PEG)來修飾納米粒子表面，形成水合層，防止蛋白質(zhì)吸附，這被稱為“隱形”效應(yīng)^[84]。聚合物的密度、分子量和鏈結(jié)構(gòu)影響隱形效應(yīng)的有效性。除了PEG外，還有其他替代的隱形聚合物，如聚甜菜堿、聚丙烯酰胺接枝瓜爾膠等，它們通過靜電相互作用或其他機(jī)制來抵抗蛋白質(zhì)吸附^[85]。天然來源的聚合物，如透明質(zhì)酸和多糖，也被研究作為潛在的隱形聚合物，可以降低蛋白質(zhì)吸附，同時(shí)可能降低NPs的免疫原性^[86]。使用抗體或配體對(duì)納米粒子表面進(jìn)行功能化，可以實(shí)現(xiàn)靶向輸送^[87]。另一方面，PC的形成可能會(huì)影響配體-受體相互作用，因此需要采取措施來減少這種影響，如通過用額外的PEG靶向配體填充PC未占據(jù)的納米粒子表面^[88]。   

白蛋白和載脂蛋白是常用的涂覆功能蛋白質(zhì)。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于NPs的設(shè)計(jì)中，旨在提高膠體穩(wěn)定性、減少非特異性細(xì)胞攝取，并延長NPs的循環(huán)半衰期。白蛋白可以與其他蛋白質(zhì)(如糖蛋白或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白)相互作用，促進(jìn)NPs遞送至靶組織。預(yù)先涂覆白蛋白是通過將NPs與白蛋白一起孵育，使其物理吸附到NPs表面而實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，使用白蛋白預(yù)包被的NPs在黑色素瘤細(xì)胞中的細(xì)胞攝取方面表現(xiàn)出更好的效果，顯示出比未包被的對(duì)照更高的生物利用度、腫瘤分布和抗腫瘤功效^[89]。載脂蛋白在NPs設(shè)計(jì)中的應(yīng)用主要涉及其促進(jìn)NPs穿過腦內(nèi)皮的運(yùn)輸，如ApoE等載脂蛋白的涂層可增強(qiáng)NPs的腦向性^[90]。近年來對(duì)于PC的最新研究集中于使對(duì)NPs進(jìn)行表面修飾使其吸引特定蛋白，形成具有特殊功能的PC。Kim等^[91]使用多巴胺涂覆介孔SiO₂ NPs吸引白蛋白，增強(qiáng)siRNA傳遞以抑制腫瘤生長。Li等^[92]設(shè)計(jì)馬來酰亞胺修飾的PLGA NPs與白蛋白結(jié)合，增強(qiáng)血液循環(huán)并減弱腫瘤積累。G?ppert等^[93]制備出聚山梨酯穩(wěn)定的NP吸引載脂蛋白結(jié)合，并促進(jìn)它們通過LDLR輸送到大腦。隨后Prabhaka等^[94]采用聚山梨醇酯80作為NPs載體的表面改性劑，以改善藥物向大腦的輸送。Chen等^[95]在脂質(zhì)體納米粒(lipid nanoparticle, LNP)表面修飾了正電荷，吸引了玻連蛋白，提高了細(xì)胞攝取，尤其是α3陽性細(xì)胞。Santi等^[96]設(shè)計(jì)促使轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合肽與Au NPs原位結(jié)合，增加了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)細(xì)胞對(duì)NP的攝取。Zhang等^[97]制備含有聚乙烯亞胺涂層的納米顆粒(RCP NPs)吸引了視黃醇結(jié)合蛋白和白蛋白，其中蛋白質(zhì)結(jié)合阻止了NPs的聚集，并導(dǎo)致細(xì)胞攝取譜偏向于肝星狀細(xì)胞。RCP NPs進(jìn)入肝臟中的肝星狀細(xì)胞，并將下調(diào)膠原蛋白的反義寡核苷酸遞送至肝星狀細(xì)胞以減少肝纖維化。    

通過對(duì)納米粒子表面的蛋白進(jìn)行選擇性設(shè)計(jì)，可以提高納米粒子向靶向器官的遞送效果。Zhang等^[98]使用短肽裝飾的脂質(zhì)體捕獲血漿中的載脂蛋白A1、載脂蛋白E和載脂蛋白J，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦腫瘤的短干擾RNA遞送，并在外泌體模擬物表面修飾二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-多肽，通過與脂蛋白受體相關(guān)蛋白1的相互作用促進(jìn)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)，將多西紫杉醇遞送至膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。通過控制表面成分，如陽離子脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物的DNA涂層，可以改善NPs的PC輪廓，提高對(duì)腫瘤的遞送效果^[99-100]。對(duì)納米晶體使用表面穩(wěn)定劑，則會(huì)影響藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布曲線和抗腫瘤作用^[101]。表面成分的不同結(jié)構(gòu)導(dǎo)致PC特征的變化，影響LNP在體內(nèi)的器官向性，Zhao等^[102]研究發(fā)現(xiàn)咪唑基類脂質(zhì)的LNP傾向于靶向脾臟，而尾部帶有酯鍵的LNP則主要沉積在肺部。Shen等^[103]研究發(fā)現(xiàn)葡聚糖包被的亞鐵NPs可以通過激活凝集素補(bǔ)體途徑靶向脾臟中的B細(xì)胞。Astarita等^[104]將陽離子脂質(zhì)復(fù)合物利用人造PC預(yù)功能化，改善角膜上皮細(xì)胞的攝取，提高在眼球內(nèi)的遞送效果。    

在許多情況下，不受控制的PC會(huì)干擾納米粒子NPs的預(yù)期功能，導(dǎo)致NPs在體內(nèi)積累、免疫反應(yīng)受損以及靶向特異性相互作用的喪失。與此同時(shí)，血液中存在一些特定的蛋白質(zhì)，如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和載脂蛋白，它們能夠增強(qiáng)NPs向特定器官的輸送。因此，可以合理地設(shè)想使用所需的蛋白對(duì)NPs進(jìn)行預(yù)功能化，或通過工程設(shè)計(jì)表面以優(yōu)先在原位選擇這些蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合。

針對(duì)PC的研究應(yīng)用仍然面臨許多挑戰(zhàn)。首先，由于醫(yī)療條件和疾病的不同，特定蛋白質(zhì)的含量存在很大差異。其次，蛋白質(zhì)的變異性可能會(huì)破壞基于人群的研究確定的PC效用。第三，對(duì)非蛋白質(zhì)生物分子在納米粒子性能中的作用了解有限。因此，未來的研究需要深入了解非蛋白質(zhì)冠的功能以及其成分之間的相互作用?？梢越Y(jié)合計(jì)算機(jī)輔助預(yù)測PC與NPs的相互作用，并根據(jù)每個(gè)患者的情況定制NPs的設(shè)計(jì)。最后，雖然PC分析已成為NPs表征的常見做法，但大多數(shù)研究依賴于動(dòng)物源血清中NPs的體外培養(yǎng)。目前的方法在許多方面都存在局限性。血液蛋白質(zhì)成分因物種而異，因此通過動(dòng)物血清獲得的信息可能無法推廣到人類。體外研究通常在靜態(tài)條件下進(jìn)行，無法考慮可能影響PC與NPs相互作用的血流剪切應(yīng)力。此外，PC的分析主要集中在HC的研究，而沒有反映在循環(huán)中不斷重塑的SC的功能。因此，為了準(zhǔn)確預(yù)測PC與NPs相互作用以及進(jìn)行相應(yīng)的納米粒子設(shè)計(jì)，需要發(fā)展能夠反映體內(nèi)動(dòng)態(tài)條件的穩(wěn)健體外方法。  purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質(zhì)組學(xué)-生物磁珠專家）。

4  展望

PC已成為反映NPs行為的標(biāo)簽，由于NPs在人體內(nèi)形成PC會(huì)產(chǎn)生潛在的風(fēng)險(xiǎn)和不確定的影響，近年來對(duì)PC的研究備受關(guān)注。PC對(duì)NPs的影響體現(xiàn)在諸多領(lǐng)域：例如生物成像、生物傳感、藥物輸送、診斷和治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，生物傳感器、肥料和生長促進(jìn)劑等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，以及營養(yǎng)載體、食品添加劑和功能性食品等食品領(lǐng)域。因此，了解PC的形成機(jī)制和影響因素對(duì)理解和預(yù)測其體外和活體反應(yīng)至關(guān)重要。本文回顧了近年來對(duì)PC形成機(jī)制及影響因素的研究進(jìn)展，主要介紹了NPs特性、環(huán)境因素以及分子間作用力三方面的影響，同時(shí)對(duì)PC的預(yù)防和利用進(jìn)行了總結(jié)。了解蛋白冠的形成機(jī)制和影響因素會(huì)幫助我們理解蛋白冠的形成過程并針對(duì)特定需求來控制特定蛋白冠的形成。雖然在PC的表征方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但影響PC結(jié)構(gòu)的時(shí)間、環(huán)境變化以及蛋白質(zhì)的競爭性吸附/解吸所帶來的影響仍需進(jìn)行大量的研究。鑒于PC的復(fù)雜性，需要更詳細(xì)地研究以下方面。首先，要跟蹤PC成分在運(yùn)輸過程中的動(dòng)態(tài)變化，研究蛋白質(zhì)在NPs上的結(jié)構(gòu)、特性和停留時(shí)間。其次，NPs表面PC所形成的生物界面可能會(huì)在細(xì)胞、組織、器官的層面上引發(fā)特殊反應(yīng)，需要了解PC如何誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，并針對(duì)不同需求制定不同功能的NPs。最后，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)PC差異的研究，解決不同物種、患有不同疾病人群的血液環(huán)境改變以及蛋白質(zhì)變異性導(dǎo)致的PC變化，發(fā)展能夠反映體內(nèi)動(dòng)態(tài)條件的穩(wěn)健體外方法。根據(jù)進(jìn)入人體后產(chǎn)生的不同生物、化學(xué)反應(yīng)選擇適合的NPs。對(duì)PC的認(rèn)識(shí)仍處于起步階段，對(duì)PC的生物效應(yīng)的研究僅局限于個(gè)體，很少有總體的客觀規(guī)律。現(xiàn)在迫切需要了解PC對(duì)生理系統(tǒng)的影響，以減輕潛在的危害。未來，我們可以通過一系列的實(shí)驗(yàn)和模擬研究，進(jìn)一步探究蛋白冠形成機(jī)制和影響因素。例如利用高分辨率的成像技術(shù)來觀察蛋白冠結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)，并進(jìn)一步研究其組裝動(dòng)力學(xué)和三維結(jié)構(gòu)。此外，還可以基于計(jì)算機(jī)模擬和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，來預(yù)測蛋白質(zhì)突變對(duì)PC結(jié)構(gòu)的影響。

purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質(zhì)組學(xué)-生物磁珠專家）。