磁性分選陽性細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案（MACS）
2020-10-4 10:41:07點(diǎn)擊：
實(shí)驗(yàn)方法原理：細(xì)胞層（buffy coat）或另一種混合細(xì)胞懸液同與抗體連接的微珠混合，稀釋后放人一個磁性分離柱中。與微珠結(jié)合的細(xì)胞會貼到柱子的側(cè)壁上，而未結(jié)合磁珠的細(xì)胞則流過柱子。將分離柱從磁場移開，結(jié)合微珠的細(xì)胞就從柱子上釋放，用針?biāo)◤闹惺占?br />
實(shí)驗(yàn)材料：緩沖液
儀器、耗材 ：磁性細(xì)胞分離器 分離柱適配器 陽性選擇柱 符合收集容積的收集器 磁性微珠
實(shí)驗(yàn)步驟
一、磁微珠標(biāo)記
1. 標(biāo)準(zhǔn)方法分離外周血單核細(xì)胞或經(jīng)酶消化法及其他方法制備的細(xì)胞懸液。2. 用 Ficoll-Paque 去除死細(xì)胞。
3. 用 30 μm 尼龍網(wǎng)篩或?yàn)V膜（Myltenyi，# 414: 07）過濾細(xì)胞去除細(xì)胞團(tuán)塊 （濾膜應(yīng)用前用緩沖液濕潤）。
4. 緩沖液（D-PBS，pH 7.2 ，含 0.5 % BSA 和 2 mmol/L EDTA）洗滌細(xì)胞，離心。
5. 重新懸浮離心細(xì)胞，每 107 個細(xì)胞懸浮于 80 μl 緩沖液（80 μl 為最低限量，即使總細(xì)胞數(shù)低于 107個）。
6. 按每 107 個細(xì)胞加微珠標(biāo)記液 20 μl。
7. 混勻，6~12℃ 孵育 15 min (對于更少的細(xì)胞，用同樣體積的微珠標(biāo)記液）。
8. 加入 10~20 倍于標(biāo)記液體積的緩沖液稀釋細(xì)胞。
9. 300 g 離心 10 min。
10. 去上清，按每 108 個細(xì)胞加緩沖液 500 μl 重新懸浮結(jié)合了微珠的細(xì)胞。
二、陽性磁性分離
11. 將分離柱放入 MACS 分離器（MiniMACS、MidiMACS、VarioMMMACS，或 SuperMACS（Miltenyi））的磁性區(qū)。
12. 洗柱：MS＋/ RS＋ 500 μl； LS＋/ VS＋ 3 ml。
13. 將細(xì)胞懸液加人分離柱中：MS＋/ RS＋ 500~1000 μl； LS＋/ VS＋ 1~10 ml。
14. 讓陰性細(xì)胞流過分離柱。
15. 用緩沖液淋洗柱子： MS＋/ RS＋ 3×500 μl； LS＋/ VS＋ 3×3 ml。
16. 將分離柱從分離器中取出放置在收集管上。
17. 用吸管加適量緩沖液于柱中（MS＋/ RS＋ 1 ml； LS＋/ VS＋ 5 ml），推動針管式活塞洗脫陽性標(biāo)記細(xì)胞。
18. 細(xì)胞計(jì)數(shù)，用生長培養(yǎng)基調(diào)整濃度。
(a)原代培養(yǎng)調(diào)整為1×105~1×106 /ml，接種于培養(yǎng)瓶中；
(b)克隆培養(yǎng)調(diào)整為 10~1000 /ml，接種于培養(yǎng)皿。
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