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MS-CBX001
1 ml
MS-CBX010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
MagStart-Carboxyl 是由超多孔聚合物網(wǎng)絡(luò)組成的磁性聚合物微載體。通過與各種化學(xué)偶聯(lián)劑對微粒（或生物制品）進(jìn)行化學(xué)活化來共價偶聯(lián)生物配體。這可以通過在單步偶聯(lián)反應(yīng)中使用EDC[1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺]和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS或Sulfo-NHS）試劑的水性碳二亞胺介導(dǎo)的活化過程來實現(xiàn)，或在兩步反應(yīng)中，在微粒上的羧基殘基活化后加入含胺分子。MagStart微球技術(shù)的進(jìn)步使生物分子可在整個微?？臻g滲透和結(jié)合，為生物分子的固定化提供了極高的結(jié)合能力?？商娲鶰agReSyn?-Carboxyl的使用。
MagStart-Carboxyl微粒極高的官能團(tuán)密度為生物分子偶聯(lián)提供了高濃度的反應(yīng)位點。MagStart-Carboxyl的高結(jié)合載量允許減少高活性功能微粒的體積來實現(xiàn)實驗方案小型化，進(jìn)而最大限度地減少所需試劑的體積，從而允許以更小的體積應(yīng)用固定化配體。MagStart可快速磁分離（<10 秒），通過磁壓縮減少了洗滌和洗脫過程中顆粒間隙，從而提高了效率和回收率，強(qiáng)磁性還可防止微粒的意外丟棄而避免樣品損失。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Immobilization of proteins, peptides, enzymes, antibodies and other ligands
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Carboxylic acid (COOH)
Binding capacity
≥20 mg/ml (BSA)
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 3.5~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4~8?C until expiry date on label. DO NOT FREEZE!
注意：不當(dāng)儲存、微粒干燥、細(xì)菌污染或離心回收可能導(dǎo)致容量/性能的不可逆損失。使用前應(yīng)充分混勻。
2. 偶聯(lián)流程
2.1. 樣品制備
偶聯(lián)緩沖液的離子強(qiáng)度和pH值是有效固定化配體的重要考慮因素。偶聯(lián)緩沖液應(yīng)不含伯胺類化合物（例如Tris）。請仔細(xì)閱讀說明指南，以確保您使用的是合適的耦合緩沖器。如果要偶聯(lián)的樣品中含有可能干擾偶聯(lián)反應(yīng)的污染物，如鹽、糖、穩(wěn)定劑或化合物，則應(yīng)通過脫鹽、超濾或類似技術(shù)從樣品中去除這些成分。NHS-EDC活化羧基微粒的偶聯(lián)效率取決于配體濃度，可能需要優(yōu)化才能達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。
注意：所有試劑都應(yīng)是新鮮制備的，并具有分析級，以確保最佳性能。下面描述的程序、方法、緩沖溶液和配體僅供參考，并非旨在限制。MagStart-Amine與一系列不同的配體固定緩沖液兼容。偶聯(lián)量取決于配體，應(yīng)優(yōu)化條件以確保獲得預(yù)期結(jié)果。
2.2. MagStart-Carboxyl的平衡
MagStart-Carboxy以 20 mg/ml懸液形式保存于20% 乙醇中。使用前需去除運(yùn)輸溶液，并在結(jié)合液中平衡微球。推薦的方案可按比例放大或縮小以滿足要求。當(dāng)前方案約結(jié)合 ~1 mg 蛋白質(zhì)。
1）渦旋混合3秒徹底重懸羧基磁珠以確保均勻。
2）將 50 μl （1 mg） MagStart-Carboxyl羧基磁珠轉(zhuǎn)移到新離心管中。
3）磁分離，磁顆粒附著在離心管壁。
4）用移液槍吸棄上清。
5）在200μl用于配體偶聯(lián)的緩沖液（例如活化緩沖液，0.1M MES第2.3節(jié)）中洗滌/平衡微球，等待1分鐘進(jìn)行平衡。
6）將離心管放在磁力架上，將管子與磁力架一起倒置兩次，以收集蓋子中殘留的任何磁微粒。
7）用移液管抽吸除結(jié)合緩沖液，重復(fù)步驟5和6兩次，共洗滌三次。
8）從步驟6中取出緩沖液后，MagStart-Carboxyl羧基磁珠即可進(jìn)行活化以進(jìn)行配體結(jié)合。
2.3. 用EDC和NHS活化MagStart-Carboxyl
1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽（EDC） 是一種水溶性偶聯(lián)劑，可用于活化微粒上存在的羧基，N-羥基琥珀酰亞胺活化（NHS）可以協(xié)助該活化過程，以提供能夠與蛋白質(zhì)等上存在的伯胺反應(yīng)的中間酯：
1）根據(jù)您的固定要求準(zhǔn)備足夠的活化液?；罨芤汉校?0 mM EDC 和 50 mM NHS 在合適的緩沖液中，例如 0.1 M MES、0.5 M NaCl、pH 6.0。示例：將 28.8 mg NHS 和 19.1 mg EDC 溶解在 5 ml 緩沖液中。使用前確保 EDC 和 NHS 完全溶解。
2）將0.5ml活化液加入到按2.2制備的1mg平衡好的磁性微球中。
3）在室溫下振蕩磁性微球懸浮液15分鐘。
4）磁分離，移液槍吸出上清液并丟棄。
5）用1ml固定化緩沖液洗滌微球三次，例如PBS，pH 7.0。在每次洗滌程序之間留出 10 秒的平衡時間。
2.4蛋白質(zhì)偶聯(lián)程序
注意：如果用于固定的蛋白質(zhì)含量較低，則可能會發(fā)生顆粒聚集。如果您沒有足夠的蛋白質(zhì)與磁珠偶聯(lián)，則可以將載體蛋白（如 BSA 或酪蛋白）與目標(biāo)蛋白混合，以提供足夠的含量以避免聚集。
1）在合適的偶聯(lián)緩沖液（不含伯胺，例如PBS，pH 7.0）中配制要偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，并添加到磁性微球懸浮液中。
2）使用倒置混勻器在室溫下反應(yīng)2-24小時，或溫度敏感的配體在4°C下反應(yīng)。
3）將離心管放在磁力架上。
4）通過移液器吸取上清，丟棄或保留以備后續(xù)測定偶聯(lián)效率。
5）僅用200μl偶聯(lián)緩沖液洗滌兩次（洗滌之間平衡1分鐘）。磁分離，吸棄上清。
6）加入500μl過量含胺封閉劑的合適緩沖液（例如，200mM乙醇胺或天冬氨酸，PBS，pH 7.0），并在室溫下孵育3小時（或在4?C下孵育12+小時）以淬滅微球上任何剩余的胺反應(yīng)性殘留物。
7）磁分離吸棄多余的淬火劑。
8）可選：用含有 0.5–1 M NaCl 的 500 μl 合適緩沖溶液洗滌 3 次，以去除可能的非共價結(jié)合蛋白質(zhì)和非反應(yīng)物。磁分離回收微球并吸出洗滌液。
9）在合適體積的緩沖液中洗滌/平衡含有固定化配體的微粒，以備進(jìn)一步應(yīng)用或儲存。微?，F(xiàn)在已準(zhǔn)備好用于您的下游實驗。
10）固定化生物制品可與合適的防腐劑（例如含有0.05%疊氮化鈉的磷酸鈉緩沖液）一起儲存4°C。不要冷凍微球。
3. 常見問題
問題
可能原因
改善方法
配體不與微粒結(jié)合
活化液不穩(wěn)定
使用新制備活化液
不正確的結(jié)合pH
確?；罨?/span>pH 5-6.5之間
校準(zhǔn)pH計
蛋白質(zhì)降解
添加蛋白酶抑制劑或新配蛋白溶液
樣品或溶液中的干擾物阻止結(jié)合
確保緩沖液不含伯胺，例如不使用Tris或甘氨酸緩沖液。如含則需脫鹽
微粒數(shù)量不足
增加顆粒的數(shù)量
蛋白質(zhì)/配體含量過低
使用濃度更高的配體溶液，將總蛋白濃度增加到2~10 mg/ml
參考文獻(xiàn)：
1. Dutt M, Duong M N, Bringans S, et al. Semi-Automated Lectin Magnetic Bead Array (LeMBA) for Translational Serum Glycoprotein Biomarker Discovery and Validation[M]//Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols. New York, NY: Springer US, 2023: 395-411.
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