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1. 概述
蛋白磷酸化參與多種細(xì)胞過(guò)程，約30%蛋白可實(shí)現(xiàn)磷酸化修飾。很多研究聚焦于蛋白的翻譯后修飾。然而，因磷酸化肽豐度低、化學(xué)計(jì)量低和理化特性特殊等因素，導(dǎo)致長(zhǎng)期以來(lái)蛋白質(zhì)組尺度上的磷酸化研究都是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。因此，當(dāng)前迫切需要能特異富集磷酸化肽、且與質(zhì)譜分析兼容的富集技術(shù)。
二氧化鈦具有富集磷酸絲氨酸（pSer）、磷酸蘇氨酸（pThr）和磷酸酪氨酸（pTyr）殘基的選擇性親和力。TiO2-功能性磁珠（PuriMag Si-TiO2）是一種專有的磁性材料微粒載體，能在復(fù)雜生物樣品的蛋白消化物中簡(jiǎn)單、方便、高效、高特異、高重復(fù)性富集磷酸化肽。磁珠表面的二氧化鈦納米粒子對(duì)于單磷酸化肽和多磷酸化肽沒(méi)有明顯的偏好，因而非常適合單步富集磷酸化肽用于基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。PuriMag Si-TiO2以其出色的特異性，超越競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的產(chǎn)品，具有較高的磷酸化肽回收率。PuriMag Si-TiO2技術(shù)的優(yōu)勢(shì)如下：
l 對(duì)磷酸化肽高特異性；
l 對(duì)單磷酸化肽和多磷酸化肽無(wú)明顯的偏好；
l 小于10s的快速磁響應(yīng)性，減少樣品損失，更適合自動(dòng)化操作；
l 抗氧化特性，降低樣品被污染風(fēng)險(xiǎn)。
2. 產(chǎn)品信息
名稱
PuriMag Si-TiO2
用途
分離富集磷酸化肽
磁核
四氧化三鐵
表面聚合物
二氧化硅
表面功能基團(tuán)
二氧化鈦（TiO2）
結(jié)合容量
>10 μg phosphopeptides /mg bead
尺寸
~400 nm
濃度
25 mg/ml，保存于20% 乙醇
穩(wěn)定性
pH 2.5–12; 4–60℃
儲(chǔ)存
4–8℃，避免冷凍
3. 結(jié)合和洗脫程序
上樣緩沖液（Loading buffer）: 1 M glycolic acid in 80% acetonitrile (ACN) and 5% trifluoroacetic acid (TFA) ；
洗滌緩沖液（Wash buffer）: 80% ACN, 1% TFA ；
洗脫緩沖液（Elution buffer）: 1% NH4OH；
影響磷酸肽結(jié)合的因素包括：緩沖液的組成、pH值以及是否存在污染物/干擾化合物。磁珠使用量應(yīng)根據(jù)應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化，建議使用過(guò)量的含磷酸肽樣品使磁珠飽和。
注意：為確保最佳性能，所有的試劑應(yīng)為分析級(jí)新鮮配制。后續(xù)的操作流程所使用的緩沖液僅作為示例，并非限制。PuriMag Si-TiO2磁珠在磷酸肽富集過(guò)程中與一系列不同的緩沖液兼容。為達(dá)到最好的純度和產(chǎn)量，應(yīng)優(yōu)化的具體富集過(guò)程的實(shí)驗(yàn)條件。
3.1 PuriMag Si-TiO2磁珠的平衡
PuriMag Si-TiO2磁珠以25 mg/ml濃度，保存于20% 乙醇中。使用前應(yīng)對(duì)磁珠進(jìn)行洗滌和平衡，可根據(jù)實(shí)際需要放大和縮小磁珠用量。最小體積為10微升的微粒懸浮液是確保磁珠能與緩沖液分離。以下方案是從約500μg的總蛋白質(zhì)消化液中純化磷酸肽。
1）渦旋混合PuriMag Si-TiO2磁珠以確保均勻分散。
2）轉(zhuǎn)移40μl（1mg）PuriMag Si-TiO2磁珠到2ml離心管。
3）將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
4）用200μl的70％乙醇溫和洗滌微粒（例如間或渦旋混合）5分鐘。
5）將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
6）重復(fù)步驟4和5。
7）用100μl的1％NH4OH輕輕洗滌微粒（例如間或渦旋混合）10分鐘。
8）將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
9）50μl上樣緩沖液平衡磁珠60秒。
10）將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
11）重復(fù)第9步和第10步兩次，共三次平衡。
13）除去上樣緩沖液后，PuriMag Si-TiO2磁珠可用于結(jié)合目標(biāo)磷酸肽。
3.2 磷酸肽富集過(guò)程
1) 用上樣緩沖液調(diào)整消化后蛋白至合適濃度（包含~ 500μg總蛋白）與平衡好的PuriMag Si-TiO2磁珠相匹配。
注意：若磷酸肽為固體，請(qǐng)用不低于100μl的上樣緩沖液溶解。
2) 渦旋或移液器吸打混勻磁珠。
3) 室溫孵育20分鐘，過(guò)程中確保樣品和磁珠的混合懸浮。
4) 將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
5) 100μl的上樣緩沖液溫和洗滌30秒，去除未結(jié)合的樣品。
6) 將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
7) 100 μl洗滌緩沖溫和洗滌2分鐘，去除非特異性結(jié)合的多肽。
8) 將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
9) 重復(fù)第7步和第8步2次，共洗滌3次。
10) 使用溶液（10% ACN和0.2% TFA）額外洗滌兩次。
11) 80μl洗脫緩沖液洗脫15分鐘，確保洗脫過(guò)程中磁珠的懸浮和混合。
12) 重復(fù)第11步，再用80μl洗脫緩沖液洗脫兩次。共獲得240μl洗脫樣品。為獲得濃縮樣品，可用3×40μl洗脫緩沖液用于洗脫過(guò)程。
13) 將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移取上清到一新離心管。
14) 增在240μl洗脫液中加入60μl 10%甲酸（FA）酸化樣本。
15) 用質(zhì)譜分析樣品。質(zhì)譜分析前，可對(duì)樣本脫鹽（如C18），濃縮（如真空離心或凍干）。
4. 問(wèn)題解決方法
問(wèn)題
可能原因
解決方案
磷酸肽不結(jié)合磁珠
結(jié)合pH不合適
確保上樣緩沖液pH為2.5-3.0
使用的磁珠太少
增加磁珠使用量
反應(yīng)時(shí)間不夠
增加孵育時(shí)間至30分鐘
干擾物質(zhì)阻礙結(jié)合
對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽或透析
非特異性結(jié)合
洗滌體積不夠
增加洗脫體積
洗滌時(shí)間不夠
增加洗脫時(shí)間
緩沖液配制有誤
正確配制新鮮的緩沖液
磷酸化多肽回收率低
不正確的洗脫緩沖液濃度
確保洗脫緩沖液NH4OH高于0.5%
樣品濃度過(guò)低
冷凍干燥或真空離心濃縮樣品
樣品中污染物導(dǎo)致的離子抑制
對(duì)制備的磷酸化多肽脫鹽（如C18柱）
引用該產(chǎn)品文獻(xiàn)：
1. Bin Luo, et al. Metal–Organic Framework-Derived Hollow and Hierarchical Porous Multivariate Metal-Oxide Microspheres for Efficient Phosphoproteomics Analysis, ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 29, 34762–34772, https://doi.org/10.1021/acsami.1c10795 (TiO2磁珠富集磷酸化多肽)
2. Liu, Jun, et al. Direct analysis of metabolites in the liver tissue of zebrafish exposed to fiproles by internal extractive electrospray ionization mass spectrometry, Analyst, 2021, 146(14): 4480-4486，http://dx.doi.org/10.1039/D1AN00490E, （TiO2磁珠）
3. Binbin Wang, et al. Phosphonate-Functionalized Ionic Liquid: A New Surface Modifier Contributing to the Enhanced Enrichment of Phosphorylated Peptides, ACS Sustainable Chem. Eng. 2021, 9, 23, 7930–7940, https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.1c02119 (TiO2磁珠)
4. Bin Luo, et al. Bifunctional magnetic covalent organic framework for simultaneous enrichment of phosphopeptides and glycopeptides, Analytica Chimica Acta, Volume 1177, 2021, 338761, https://doi.org/10.1016/j.aca.2021.338761. (TiO2磁珠富集磷酸化多肽)
5. 鄒倫妃,張啟偉,肖琛等.基于酰胺化的化學(xué)標(biāo)記技術(shù)在磷酸化多肽分析中的應(yīng)用[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2022,43(04):463-472. （Si-TiO2用于磷酸化多肽富集）
6. 劉軍. 基于內(nèi)部萃取電噴霧電離質(zhì)譜的典型含氟污染物誘導(dǎo)魚類代謝紊亂研究[D].吉林大學(xué),2022.DOI:10.27162/d.cnki.gjlin.2022.001228. （Si-TiO2用于代謝物富集）
7. Lihong Gao, et al. Nanocomplexes with anchored Rubpy32+-tetraethylene pentamine electrochemiluminescence system: Self-enhanced coupled photothermal strategy detection of thyroglobulin, Journal of Electroanalytical Chemistry, Volume 947, 2023, 117767, https://doi.org/10.1016/j.jelechem.2023.117767. (TiO2磁珠修飾)
8. 鄒倫妃.基于化學(xué)標(biāo)記法篩選2,6-二氯苯醌的生物毒性標(biāo)志物[D].江漢大學(xué),2023.DOI:10.27800/d.cnki.gjhdx.2023.000396. （Si-TiO2用于磷酸化多肽富集）
9. Sen Zhang, et al. Magnetic Ti3C2 MXene Nanosheets Prepared for Enrichment of Phosphopeptides, ACS Appl. Mater. Interfaces 2023, 15, 13, 16505–16514, https://doi.org/10.1021/acsami.3c00848 (TiO2磁珠富集磷酸化多肽)
10. Gongzhen Liu, et al. Proteomics and phosphoproteomics reveal novel proteins involved in Cipangopaludina chinensis carcasses. Front. Chem., 29 August 2024, Sec. Analytical Chemistry, Volume 12 - 2024 | https://doi.org/10.3389/fchem.2024.1416942 (TiO2磁珠和IMAC-Ti磁珠用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析)
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