蛋白質(zhì)制備 ● 定時(shí) 2 小時(shí)
1 將 ThermoMixer 預(yù)熱至 60 °C。
2 在 1.5 mL 試管中以 1 mg/mL 的復(fù)溶溶液制備 1 mL BSA 儲(chǔ)備溶液。
關(guān)鍵步驟 如果使用需要還原和烷基化但尚未進(jìn)行還原和烷基化的蛋白質(zhì)混合物（例如細(xì)胞裂解物），請(qǐng)?jiān)诖颂幱媚臉悠反?BSA 輸入并按照說(shuō)明進(jìn)行操作。
3 將準(zhǔn)備好的BSA原液管在60°C的ThermoMixer中加熱30分鐘，以1000 r.p.m混合。
4 從熱混合器中取出試管，使其在實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)的架子中冷卻至室溫。
5 向BSA管中加入100μL的 IAA儲(chǔ)備液來(lái)烷基化還原二硫化物，然后室溫避光孵育30分鐘。
關(guān)鍵步驟 IAA 對(duì)光敏感。溶液應(yīng)新鮮制備，并在黑暗中進(jìn)行孵育。
6 向BSA管中加50μL的DTT原液淬滅烷基化反應(yīng)，然后室溫孵育15分鐘。
暫停點(diǎn) 制備的樣品（本例中為BSA）可以無(wú)限期地儲(chǔ)存在-80°C下。
SP3 蛋白純化和消化 ● 定時(shí) 30 分鐘 + 18 小時(shí)孵育
7 將 ThermoMixer 預(yù)冷至 24 °C。
8 在復(fù)溶溶液中將制備的10 μg（10 μL 制備的1 mg/mL 原液）BSA稀釋至最終體積48 μL。
9 加入100 μg的SP3磁珠并移液混勻。這是2 μL（50μg/μL SP3）磁珠原液，終體積為 50 μL 蛋白質(zhì)溶液。
關(guān)鍵步驟 確保溶液中SP3磁珠完全均質(zhì)化。輕柔移液吹打混合?；旌喜划?dāng)會(huì)降低SP3的蛋白質(zhì)回收效率。
10 為誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與珠子結(jié)合，向含SP3珠子的BSA混合物中加入50 μL乙醇。短暫搖晃試管以均質(zhì)化。
關(guān)鍵步驟 避免加入乙醇后過(guò)度搖晃混合物，盡量減少磁珠粘附在管上部而造成的損失。通過(guò)初始混合步驟完全均質(zhì)化并非必需；水相和乙醇相部分整合就足夠了。在下一步孵育中，將使用混勻儀完全混合。
11 將結(jié)合混合物在24°C的ThermoMixer中以1,000 r.p.m孵育5分鐘。
關(guān)鍵步驟 避免以>1000 r.p.m.的速度混合。快速混合會(huì)導(dǎo)致聚集的磁珠粘附管壁，可能降低蛋白回收率。
關(guān)鍵步驟 觀察孵育后磁珠的聚集。微珠的聚集表明蛋白質(zhì)在微珠表面結(jié)合。聚集量與輸入材料的數(shù)量成正比，并取決于結(jié)合條件（例如，反應(yīng)體積和珠子數(shù)量）。
12 結(jié)合完成后，將試管放入磁力架中并孵育，直到珠子遷移到管壁上。
關(guān)鍵步驟 觀察被磁架吸引時(shí)管壁上珠子的結(jié)合模式。珠子在內(nèi)管壁周圍分布是結(jié)合材料的良好指示。非常細(xì)的珠子線可能表明少量或沒(méi)有結(jié)合的蛋白質(zhì)。
13 取出未結(jié)合的上清液并將其丟棄在適當(dāng)?shù)膹U液容器中。
關(guān)鍵步驟 從試管中取出上清液，注意不要破壞磁珠。
關(guān)鍵步驟 在故障排除過(guò)程中，可以保留上清液并通過(guò)另一種測(cè)定法（例如，SDS-PAGE）進(jìn)行分析，以檢查SP3結(jié)合步驟的效率。在該上清液中應(yīng)觀察到很少或沒(méi)有蛋白質(zhì)。
14 從磁架上取下試管，加入180 μL的80%乙醇SP3沖洗液和移液器混合以復(fù)溶并沖洗珠子。
關(guān)鍵步驟 在移液器混合和沖洗SP3珠子時(shí)，沒(méi)必要過(guò)于激烈。強(qiáng)力混合會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)損失。建議使用200 μL吸頭進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)移液，在用180 μL體積的80%乙醇復(fù)溶磁珠后進(jìn)行3~4次。
15 將試管放在磁架上并孵育，直到珠子遷移到管壁上。
16 取出上清液，注意不要破壞珠子。
關(guān)鍵步驟 上清液可以保留并通過(guò)另一種測(cè)定進(jìn)行分析（例如，SDS-PAGE）作為故障排除過(guò)程的一部分，以確定漂洗步驟中的潛在損失。在該上清液中應(yīng)觀察到很少或沒(méi)有蛋白質(zhì)。
17 再重復(fù)步驟 12-16 兩次，以完全沖洗與 SP3 珠子結(jié)合的蛋白質(zhì)。
關(guān)鍵步驟 去除最后的 80% 乙醇沖洗液后，注意從試管中取出盡可能多的殘留沖洗液（<5 μL 是最佳的），以避免殘留到酶消化步驟中。無(wú)需將 SP3 磁珠完全風(fēng)干。
18 從磁架上取下試管，加入 100 μL 含有 0.4 μg 胰蛋白酶 + rLysC 混合物的消化溶液。
關(guān)鍵步驟 加入消化液后，不要用移液管混合磁珠。避免粘稠SP3磁珠附著在移液吸頭上，從而導(dǎo)致?lián)p失。
關(guān)鍵步驟 此處胰蛋白酶用量?jī)H用于示例。常使用1：25（wt/wt）的胰蛋白酶與蛋白比例進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)消化。該比率應(yīng)根據(jù)樣品類型進(jìn)行優(yōu)化。
19 使用200 μL移液器，輕輕地將未被液體覆蓋的珠子沿管壁推入消化溶液中。不要嘗試移液混合物。
關(guān)鍵步驟 如SP3磁珠加入消解液后自然復(fù)溶成溶液，則輕搖試管將所有磁珠移入液體中。不要輕彈管子。
20 如可用，在水浴中超聲處理30秒以分散。如無(wú)超聲水浴，則37°C和1000 r.p.m.混合孵育10分鐘。
關(guān)鍵步驟 超聲處理增強(qiáng)了消化前珠子的解聚。在超聲儀中孵育，直到觀察到珠子的分解。
關(guān)鍵步驟 這種預(yù)孵育可幫助分散磁珠，更易移液。然而，孵育后磁珠可能仍非常粘稠，尤其在蛋白質(zhì)量很高的情況下?？裳娱L(zhǎng)孵育時(shí)間，以允許蛋白開始水解（如，1-2 小時(shí)），以進(jìn)一步增強(qiáng)磁珠的重建。
21移液混合以確保珠子正確復(fù)溶，并在37°C下ThermoMixer中以1000 r.p.m.混合孵育18小時(shí)。
關(guān)鍵步驟 此處使用的消化孵育時(shí)間僅用于示例。較短的持續(xù)時(shí)間可成功使用，但應(yīng)根據(jù)樣品類型優(yōu)化。
22消化完成后，將試管在20,000g下在24°C離心1分鐘。
關(guān)鍵步驟 執(zhí)行離心步驟將有助于肽回收，而不會(huì)殘留微球，因?yàn)镾P3微球會(huì)堵塞色譜柱。
23 將試管放在磁架上，直到珠子沉淀在試管壁上，然后將上清液移到新試管中。
關(guān)鍵步驟 收集上清時(shí)避免去除磁珠而干擾下游分析。重復(fù)離心（步驟22），如磁珠殘留，則回收上清。
關(guān)鍵步驟 如果樣品含有珠子，請(qǐng)勿繼續(xù)冷凍儲(chǔ)存。確保在儲(chǔ)存前完全去除珠子。
暫停點(diǎn) 制備的肽可以無(wú)限期地儲(chǔ)存在-80°C下。
24 繼續(xù)對(duì)肽樣品進(jìn)行MS分析。
