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rev. 19/04/24
Small 1 ml (50 assays)
Large 10 ml (500 assays)
概述： PuriMagTM NTA-Fe磁珠采用固定化金屬親和色譜法捕獲磷酸化肽。帶負(fù)電荷的磷酸基團被磁珠上帶正電荷的金屬離子吸引。結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 （LC-MS/MS），該方法使研究人員能夠以高度的特異性和靈敏度分離、鑒定和定量大量磷酸化肽，從而全面了解細胞和組織樣品中的磷酸化。等效替代High Select? Fe-NTA Magnetic Phosphopeptide Enrichment Kit。
背景：固定化金屬親和色譜法（IMAC）已被廣泛用于通過與負(fù)電荷簇結(jié)合來富集生物樣品中的蛋白質(zhì)和肽。二價過渡金屬離子 Co2+、Cu2+、Ni2+ 和 Zn2+ 常用于純化富含聚組氨酸或半胱氨酸的蛋白質(zhì)以及具有金屬親和力的蛋白質(zhì)。三價金屬離子 Fe3+、Ga3+、Al3+ 以及 Ti4+ 和 Zr4+ 通常用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的磷酸肽富集。亞氨基二乙酸 （IDA） 或次氮基三乙酸 （NTA） 用于將金屬離子螯合到瓊脂糖包被的磁珠。在比較研究中，NTA在選擇性捕獲和鑒定更多磷酸肽方面比IDA表現(xiàn)更好。Ga3+ 和 Fe3+ 在鑒定的磷酸化肽數(shù)量方面具有可比性。與使用 TiO2 的金屬氧化物親和色譜（MOAC）相比，IMAC- Fe3+ 的性能略好，TiO2 偏愛酸性磷酸化肽 （pI > 4），而 Fe3+偏愛酸性較低的肽 （pI < 4）。PuriMagTM NTA-Fe磁珠為磷酸化肽富集提供了一種有效的工具，對磷酸化殘基環(huán)境幾乎沒有偏見。它們可以單獨使用，也可以與基于免疫親和力的富集結(jié)合使用，以補充任何 LC-MS/MS 蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
注意： 對于長期儲存，建議用乙腈、甲醇和 0.01% 乙酸的等比例混合物 （1：1：1 v/v/v） 替換 NTA-Fe 磁珠儲存緩沖液。制備溶液并使用HPLC級試劑進行洗滌。取出儲存緩沖液，用 1 mL 水洗滌珠子 3 次。取出水洗液，向每個測定管中加入 1 mL 長期儲存緩沖液。在 4°C 下儲存。
儲存：PuriMagTM NTA-Fe磁珠以20%乙醇形式提供。對于長期儲存，用長期儲存緩沖液（1：1：1 v/v/v 甲醇、乙腈和 0.01% 乙酸）代替緩沖液。有關(guān)詳細信息，請參閱協(xié)議。儲存在4oC 下。不要冷凍珠子。
使用說明：在含尿素的緩沖液中裂解細胞，用蛋白酶消化細胞蛋白，通過反相固相萃取純化所得肽。
然后使用IMAC Beads富集磷酸化肽。通過洗滌除去未結(jié)合的肽，并用堿性pH緩沖液洗脫捕獲的磷酸化肽。對濃縮富集的肽進行LC-MS/MS分析之前，在微量尖端上進行反相純化，以脫鹽和分離肽與雜質(zhì)。詳細的實驗方案如下。
PuriMagTM NTA-Fe磁珠富集流程:
A. 溶液和緩沖液
注意：用HPLC級水制備溶液。三氟乙酸和乙腈應(yīng)為最高等級（Sequanal）。溶液的所有百分比規(guī)格均為體積/體積。
1. 上樣緩沖液: (0.1% TFA, 85% acetonitrile) For 5 mL, combine 4.25 mL ACN, 0.725 mL water, and 25 μL 20% TFA.
2. 洗滌緩沖液: (0.1% TFA, 80% acetonitrile) For 50 mL, combine 40 mL ACN, 9.75 mL water, and 250 μL 20% TFA.
3. 洗脫緩沖液: (50% acetonitrile, 2.5% ammonia) For 5 mL, combine 0.45 mL 28% ammonia with 2.05 mL water then add 2.5 mL ACN.
4. 新配 1 M ammonium bicarbonate (AMBIC) stock solution.
5. 配制 5% TFA: adding 50 μL 20% TFA to 150 μL water
B. 流程 (用于胰蛋白酶進行二次消化)
注意：在IMAC富集之前，需要使用測序級胰蛋白酶進行二次消化，以最大程度地減少遺漏的切割位點。
1. 制備測序級胰蛋白酶消化溶液（5% 乙腈、50 mM 碳酸氫銨和 100 ng/uL 胰蛋白酶）。將 33 μL 水與 2.5 μL 1M 碳酸氫銨、2.5 μL 乙腈和 12 μL （5 μg） 胰蛋白酶混合。
2. 在室溫下，將 0.5 mg 凍干肽在 1.7 mL 微量離心管中以 2,000 × g 離心 5 分鐘，以沉淀管底部的所有材料。用微量移液器移液幾次，機械地將沉淀重懸于50μL胰蛋白酶消化溶液中。
注：溶解肽后，在pH試紙上點少量（1-2μL）檢查肽溶液的pH值，pH值應(yīng)接近8.0或不低于6.0。在極少數(shù)情況下，pH 值呈酸性較強（由于在次優(yōu)凍干條件下無法充分去除肽中的 TFA），用未調(diào)整 pH 值的 1 M AMBIC 溶液滴定肽溶液。1-2 μL 通常足以中和溶液。
1. 在 37°C 下消化兩小時。通過加入 5 μL 5% TFA 終止反應(yīng)并使溶液酸化。
2. 向消化的肽溶液中加入 0.95 mL 上樣緩沖液（0.1% TFA，85% 乙腈）。
3. 在微量離心機中以10,000×g在4°C下離心5分鐘，使溶液澄清。不溶性顆?？赡芸雌饋硐喈?dāng)大。這不會造成問題，因為大多數(shù)肽都是可溶的。
4. 重懸 NTA-Fe 磁珠。使用移液器吸取 20 μL 磁珠并轉(zhuǎn)移到微量離心管中。
5. 用 1 mL 洗滌緩沖液洗滌 PuriMagTM NTA-Fe 磁珠 3 次。磁分離，取出洗滌劑，注意不要去除任何磁珠。
6. 將澄清的肽溶液轉(zhuǎn)移到裝有PuriMagTM NTA-Fe 磁珠的離心管中，確保立即混合。
7. 在室溫下以最大速度在振蕩器上孵育 30 分鐘。
8. 磁分離，然后取出上清液，注意不要取出任何磁珠。耗盡的肽溶液可以在-80°C下冷凍并保存以備其他實驗使用。
9. 加入 1 mL 洗滌緩沖液洗滌磁珠，移液槍吹打直至珠子完全重懸。磁分離，然后用微量移液器除去上清液。再重復(fù)洗滌兩次，除去任何剩余的上清液。
10. 加入 50 μL 洗脫緩沖液（50% 乙腈、2.5% 氨水），洗脫磁珠上的磷酸肽。移液槍吹打直至珠子完全重懸，磁分離。
11. 用 0.5 mL 乙腈沖洗新的微量離心管以去除任何污染物，渦旋并丟棄沖洗液。將含有洗脫的磷酸肽的上清液轉(zhuǎn)移到?jīng)_洗過的試管中。
12. 加入 40 μL 20% TFA 以酸化洗脫液。
13. 重復(fù)洗脫步驟，并將所得洗脫液混合。
14. 在 Speed-Vac 中干燥洗脫的磷酸肽（約 3 小時）。用 40 uL 0.1% TFA 復(fù)溶干燥的磷酸肽。
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