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一、概述
GST融合蛋白純化磁珠（Magarose-GSH）具有高效、快速、方便等特點，是PuriMag公司針對純化 GST 標簽融合蛋白而研制的一種新型純化介質(zhì)，可通過磁性分離方式直接從生物樣品中一步獲得高純度的目標蛋白，極大地簡化純化工藝和提高純化效率，適合科研和工業(yè)領(lǐng)域便捷地進行 GST 融合蛋白的純化。使用Magarose-GSH磁珠進行 GST Pull-down 實驗，操作簡單、快捷，具有傳統(tǒng)方法無可比擬的優(yōu)勢。
二、產(chǎn)品特性
產(chǎn)品名稱
Magarose-GSH
貨號
PMAG002
磁珠濃度
25%（v/v）in 20% 乙醇
配基及密度
20-30 umol GSH/ml 磁珠
介質(zhì)
6%交聯(lián)磁性瓊脂糖
粒徑
20-45μm
配體結(jié)合
6-10 mg GST融合蛋白/ml磁珠
保存
2~8℃保存一年
三、使用方法
1. GST 標簽蛋白純化
結(jié)合/洗雜液：140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.4；
洗脫液：50 mM Tris-HCl，50 mM 還原型谷胱甘肽，pH 8.0； 洗脫液配制方法：0.1 M Tris 溶液 50 mL，1.535 g還原型谷胱甘肽，然后用 0.1 M 鹽酸調(diào) pH到 8.0，加去離子水至 100 mL。
磁珠使用量由用戶根據(jù)目標蛋白產(chǎn)量和磁珠載量信息計算獲得，這里僅以獲得 5-10 mg 目標蛋白為例：
1.1 磁珠準備：將GST純化磁珠充分混勻，使用移液器取4 ml的磁珠懸浮液（磁珠體積為1 ml）置于離心管中，將離心管置于磁分離器上，待溶液澄清后，用移棄清液，加入去離子水反復(fù)清洗去除酒精。
1.2 磁珠平衡：加入與懸浮液等體積的結(jié)合/洗雜液，用槍頭反復(fù)吹打5次，將離心管置于磁分離器上，待溶液澄清后，移棄清液，重復(fù)洗2次。
1.3 磁珠與蛋白結(jié)合：將GST融合蛋白裂解液加入到處理好的磁珠中，顛倒混勻，室溫孵育30 min（如果目標蛋白不穩(wěn)定，建議置于2-8 ℃下孵育1 h）。
1.4 磁珠洗雜：置離心管于磁分離器，待溶液變澄清后，移上清液至新離心管，保留以備檢測。向離心管中加入2倍懸浮液體積的結(jié)合/洗雜液，使用槍頭反復(fù)吹打5次，置離心管于磁分離器，待溶液澄清，移上清液至新離心管，保留以備檢測。重復(fù)洗雜步驟2次。
1.5 洗脫：加入與懸浮液等體積的洗脫液，用移液器吹打5次，室溫下孵育5-10 min，置于磁分離器上，待溶液澄清后，吸取上清液，即為目的蛋白組分。重復(fù)上述步驟多次，分別收集洗脫組分并留樣檢測，以提高目的蛋白的回收量。
1.6 SDS-PAGE檢測：將純化所得樣品用SDS-PAGE 檢測。
注意：1. 谷胱甘肽現(xiàn)用現(xiàn)配。
2. 不同的 GST 融合蛋白與磁珠結(jié)合強弱程度不同，對大部分 GST 融合蛋白，使用含10mM 還原性谷胱甘肽的洗脫液即可洗脫目標蛋白；對少數(shù)結(jié)合能力較強的GST融合蛋白，可適當延長洗脫時間，增加洗脫次數(shù)，或提高洗脫液中還原型谷胱甘肽的濃度；
3. 結(jié)合/洗雜液和洗脫液中可添加1~5mM EDTA、1~10mM DTT、0.1~1.0%Triton X-100、0.1~1.0%Tween 20等。
1.7 磁珠清洗和保存：磁珠使用后經(jīng)過簡單清洗處理后，可以繼續(xù)用于后續(xù)的純化操作，也可長時間保存。用戶可根據(jù)磁珠使用情況選擇清洗方法，主要有：
情況1：重復(fù)使用次數(shù)較少，結(jié)合能力下降不明顯時，可采用高pH和低pH Buffer交替洗滌的方式進行清洗：
w 高pH洗（堿洗）：使用后的磁珠加入10 mL 清洗液A（0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH 8.5），漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液；
w 低pH洗（酸洗）：加入10 mL 清洗液B（0.1 M 醋酸鈉，0.5 M NaCl，pH 4.5），漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液；
w 重復(fù)堿洗、酸洗交替清洗2次，共3次。
情況2： 重復(fù)使用次數(shù)較多時，由于沉淀、變性或非特異性吸附蛋白積累，導(dǎo)致磁珠結(jié)合目標蛋白的能力明顯下降。去除沉淀或變性蛋白，可按下面的方法進行洗滌：
w 先用5 mL 6 M鹽酸胍洗滌2次，每次漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液；
w 再用10 mL 1X PBS洗滌3次，每次漩渦振蕩60 s，磁性分離，去除上清液。
情況3：去除疏水性結(jié)合物質(zhì)，可按下面方法進行洗滌：
w 先用5 mL 70%乙醇或0.1%的非離子型表面活性劑洗3次，每次漩渦60 s，磁分離，去除上清液；
w 再用10 mL 1X PBS洗滌3次，每次漩渦振蕩60 s，磁分離，去除上清液。
注意：完成情況1或2的清洗后，如用戶需繼續(xù)使用磁珠純化蛋白，需先用結(jié)合/洗雜液洗2~3次。如不需繼續(xù)使用，則用20%乙醇洗磁珠2~3次后，再加入20%（v/v）乙醇到磁珠中使總體積為4 mL，保存于2~8°C。
2．Pull-Down 操作流程
結(jié)合/洗雜Buffer：140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH7.4
洗脫Buffer：50 mM Tris-HCl, 10 mM 還原型谷胱甘肽, pH 8.0
1）磁珠準備：取適量GST純化磁珠（磁珠體積為總體積的10%），將磁珠反復(fù)顛倒，充分混勻，使用移液器取適量的磁珠懸浮液，置于離心管中，將離心管置于磁分離器，待溶液澄清后，吸棄清液。
2) 磁珠平衡：從磁分離器上取下離心管，加入與懸浮液等體積的結(jié)合液，反復(fù)吹打5-10次，置離心管于磁分離器上，待溶液澄清后，吸棄清液，重復(fù)洗滌2次。
3) 磁珠結(jié)合靶蛋白：將含GST 標簽的靶蛋白樣品加入到處理好的磁珠中，顛倒混勻。將離心管置于混合儀上，室溫孵育30 min。
4) 磁珠洗雜：將離心管置于磁分離器，待溶液澄清后，移出上清液，保留以備取樣檢測。向離心管中加入2倍懸浮液體積的洗雜液，反復(fù)吹打5-10次，置離心管于磁分離器上，待溶液變澄清后，吸棄上清液，重復(fù)上述步驟2次，即得靶蛋白-磁珠復(fù)合物。
5) 目標蛋白與靶蛋白-磁珠復(fù)合物的結(jié)合：將含有目標蛋白樣品加入到處理好的靶蛋白-磁珠復(fù)合物中，顛倒混勻。將離心管置于混合儀上，室溫孵育30 min。
6) 磁珠洗雜：將離心管置于磁分離器，待溶液澄清后，移出上清液，保留以備取樣檢測。向離心管中加入2倍懸浮液體積的洗雜液，反復(fù)吹打5-10次，將離心管置于磁分離器上，待溶液變澄清后，吸棄上清液。重復(fù)上述步驟2次。目標蛋白通過與靶蛋白的結(jié)合，從混合體系中被捕獲。
7) 目的蛋白的洗脫：在上述離心管中加入與懸浮液等體積的洗脫液，用移液器吹打5次， 然后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手動輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，5-10 min后，置于磁分離器上，待溶液變澄清后，吸取上清液，收集洗脫組分，即得到靶蛋白和目標蛋白復(fù)合物。也可以再重復(fù)操作一次，分別收集洗脫組分，留待檢測。
3．注意事項
1) 磁珠使用和保存過程中應(yīng)避免冷凍、干燥和高速離心等操作；
2) 使用本產(chǎn)品前，請務(wù)必充分振蕩使磁珠保持均勻的懸浮狀態(tài)；
3) 磁珠與溶液混合過程中，如果溶液粘稠無法通過翻轉(zhuǎn)離心管重懸磁珠，可采用移液器反復(fù)吹吸或短時漩渦混合使磁珠充分重懸；
4) 用戶可根據(jù)實際需要保留經(jīng)磁性分離移去的上清液，進行取樣檢測，以便分析純化過程和優(yōu)化蛋白純化流程；
5) 本產(chǎn)品可重復(fù)使用，重復(fù)使用時，建議純化同種蛋白，純化不同種類的蛋白時，建議使用新的磁珠，以防交叉污染；
6) 本產(chǎn)品需與磁性分離器配套使用；
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