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規(guī)格
MS-HLC001
1 ml
MS-HLC010
10 ml
1. 產品描述
MagStart-HILIC（親水作用色譜）是一種專有磁性聚合物微球，用于固相萃取 （SPE） 和從可能干擾下游分析程序的含污染物樣品中回收生物分子，用于質譜分析的樣品制備。MagStart-HILIC微球具混合模式功能，可對生物分子產生高親和力，隨后以小體積洗脫，從而在樣品處理過程中實現(xiàn)濃縮。MagStart-HILIC是復雜生物混合物（如培養(yǎng)上清液、組織提取物、血清或血漿）樣品制備的理想選擇，通過電泳、HPLC和質譜分析樣品之前，從常規(guī)污染物（如SDS、CHAPS、NP-40和尿素）中制備樣品。磁輔助進一步實現(xiàn)了常規(guī)質譜凈化工作流程的自動化，提高了重現(xiàn)性和數(shù)據(jù)質量。可替代MagReSyn?-HILIC的使用。
先進的MagStart聚合物技術允許微粒進行對高度特異性的工程設計，以解決當前基于微粒的技術的局限性。MagStart可快速磁分離（<10 秒），可防止微粒的意外丟棄而避免潛在的代價高昂的樣品損失，提高了效率和回收率。這些微粒采用多種化學表面修飾，以提供超高純度的目標蛋白，滿足嚴格的研發(fā)和質譜樣品要求。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Protein purification, proteomics, mass spectrometry sample preparation
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
HILIC, Mixed Mode
Binding capacity
≥20 mg/ml (BSA)
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 3.5~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label. DO NOT FREEZE!
注意：不當儲存、微粒干燥、細菌污染或離心回收可能導致容量/性能的不可逆損失。使用前應充分混勻。
2. 結合和洗脫程序
HILIC（親水作用液相色譜法）是通過施加有機流動相，將兩親性生物分子捕獲在固定相表面形成的富水層之間的過程。這種機制用于將生物分子與極性較低化合物分離。氫和弱靜電相互作用與生物分子在水層的保留有關，而離子添加劑（如醋酸銨和甲酸銨）常用于控制樣品pH值和離子強度。
注意：目前方案適用于MS分析中胰蛋白酶消化之前凈化還原和烷基化蛋白質，并且尚未評估肽的凈化。有關適合MS的工作流程示例，請參閱文獻。
注意：所有試劑應新鮮制備，并具有分析級，以確保最佳性能。下面描述的程序、方法、緩沖溶液和配體僅供參考，并非旨在限制。純度和產量取決于實驗條件，應針對每種應用單獨優(yōu)化。
2.1. MagStart-HILIC的平衡
MagStart-HILIC以 20 mg/ml懸浮于20% 乙醇液的形式提供。使用前需要去除運輸溶液，并在結合緩沖液中平衡微粒?？筛鶕?jù)推薦的方案按比例放大或縮小以滿足您的要求，但每個反應至少需要10μl微粒懸浮液的體積，以確保合適的磁性微粒沉淀用于緩沖液的抽吸。當前方案經優(yōu)化，可在25μl樣品體積內將50μg總蛋白與500μg磁珠（蛋白質與磁珠比例1：10）結合（該協(xié)議的最小值）。該程序已被證明在低至20 μg的總蛋白濃度下有效。
1）通過渦旋混合3秒徹底重懸MagStart-HILIC，以確保懸浮液均勻。
2）將 25 μl （500 μg）磁珠轉移到新的 2 ml離心管中（建議低蛋白結合以提高樣品回收率）。
3）磁分離，待上清液澄清。
4）用移液槍吸取出上清液并丟棄。
5）在250μl平衡緩沖液中洗滌平衡微粒，混勻1分鐘。磁分離，吸棄上清。重復該步驟1次。
6）去除結合緩沖液后，磁珠即可用于結合蛋白。
2.2. 蛋白質結合程序
蛋白應提取并溶解在含合適去污劑或離液劑的低摩爾濃度緩沖液（如 50 mM Tris pH 8.0）中，以增加蛋白樣品的溶解度。該方案已被證明可有效從50mM Tris pH 8.0或PBS的細胞裂解物中去除高達5%的SDS，2%CHAPS，1%NP40或8M尿素；制備這些相容的蛋白質溶解劑。如在質譜分析前需酶消化，則應在磁珠純化前對樣品還原和烷基化。
1）用蛋白質溶解緩沖液將樣品調節(jié)至最小25μl，并加入等體積（1：1）結合緩沖液，最終體積為50μl（最小）。
注意：結合程序適用于體積增加的樣品（例如，在蛋白質濃度較低的情況下）。
2）將樣品加入平衡的磁珠中，移液器吹打混合。
3）讓蛋白質與微粒結合30分鐘。輕柔而連續(xù)地混合，以確保在結合過程中樣品微粒相互作用良好。
4）磁分離，吸除上清液（注意：可以分析上清液以確定是否存在未結合的蛋白質）。
5）將珠子重懸于200μl洗滌緩沖液并充分混合。磁分離，吸除上清液。重復該洗滌步驟1次。
6）繼續(xù)執(zhí)行2.3進行蛋白質消化，或繼續(xù)進行替代程序2.4進行蛋白質洗脫。
2.3. 蛋白質消化程序
將含有結合蛋白質的MagStart-HILIC 微粒直接施加到胰蛋白酶溶液中，可用胰蛋白酶等酶消化蛋白質。所得肽進行質譜分析，無需進一步純化。注意：為確保有效消化，在HILIC純化之前，應還原和烷基化蛋白質（根據(jù)標準方案）。
1）將微粒與2.2吸附的蛋白質混合物重懸于50-200μl合適的消化緩沖液中，例如含有消化酶的5-10mM碳酸氫銨。對于測序級胰蛋白酶，我們建議酶與蛋白質的比例為1：10。
2）根據(jù)酶規(guī)格在合適溫度和時間段內孵育樣品。對于測序級胰蛋白酶，建議37°C下孵育 4 小時。
3）磁分離，用移液管吸出含有肽的上清液。
4）根據(jù)需要進行真空干燥或凍干以濃縮肽樣品。
5）MS分析時重懸肽，例如2%乙腈和0.2%甲酸。
6）進行質譜分析。
2.4. 蛋白質洗脫程序（替代上述 2.3）
1）將微粒與吸附的蛋白質混合物（來自2.2）重懸于50μl洗脫溶液中，并在室溫下解吸5分鐘。連續(xù)混合以確保微粒在洗脫過程中保持懸浮狀態(tài)。
2）磁分離，并用移液槍吸出上清液（含蛋白質）。
3）可重復步驟1-2，提高蛋白質回收率。
4）混合洗脫液，必要時凍干或真空過濾濃縮。
注意：對于蛋白質含量低的樣品，在分析之前可能需要樣品的濃縮（例如真空干燥或凍干）。
3. 推薦緩沖液
平衡緩沖液：100 mM乙酸銨，pH 4.5，15%乙腈
結合緩沖液：200 mM乙酸銨，pH 4.5，30%乙腈
洗滌緩沖液：95%乙腈（5%水）
洗脫液：100%乙醇 ；酸溶液：10%甲酸
4. 兼容性
目前方案已成功用于從含有以下任一成分的磷酸鹽緩沖鹽水 （PBS） 或 Tris 50mM pH 8.0 中提取的哺乳動物細胞裂解物中純化蛋白質：
? 8 M Urea ? 4% SDS
? 2% CHAPS ? 1% NP40
目前方案不適用于從含有以下組分的哺乳動物細胞裂解物中純化蛋白質：
? 6 M 鹽酸胍溶于 50 mM Tris，pH 8.0
5. 常見問題
問題
可能原因
改善方法
低蛋白結合
乙腈濃度低
確保結合前樣品最終乙腈濃度為15%，評估乙腈濃度增加至80%。監(jiān)測乙腈濃度增加時潛在的蛋白質沉淀。
含鹽量高
降低鹽濃度以增加吸附。鹽濃度不應超過 100 mM。
樣品中不相容的試劑
調整樣品制備，僅包括兼容的離液劑和HILIC緩沖液。在使用磁珠進行凈化前稀釋離液劑或增溶劑。
混合不足
使用 2 ml Protein LoBind 試管，確保易于混合并減少微粒對試管側壁的吸附。
酶解后的序列覆蓋率低或質譜信號低
消化不完全。
確保最佳制備和消解條件：確保樣品被有效還原和烷基化；消化pH =8；合適蛋白/酶比例；37°C消解。如必要，增加消化時間。
肽回收率低或洗脫不完全
消化后清洗微粒以提高回收率。通過對結合和洗脫樣品進行凝膠分析，確保蛋白質與微粒結合。
蛋白質濃度低
通過真空干燥或凍干在質譜分析之前減少樣品量。
變性劑去除不完全
雜質殘留
需要使用額外的乙腈清洗劑進行更嚴格清洗程序。
交替操作過程中蛋白洗脫不完全
將結合緩沖液的摩爾濃度降低至 20 至 50 mM 之間，以減少珠子-蛋白相互作用。
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