使用MagStart-NTA-Ni和MagStart-NH2固定化酶實例
使用MagStart-NTA-Ni和MagStart-NH2固定化酶實例：
采用MagStart-NTA-Ni和MagStart-NH2類似磁珠固定化尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（uracil phosphoribosyltransferase）制造嘧啶核苷-5′-單磷酸類似物（pyrimidine nucleoside-5′-monophosphate analogues）
? 將轉(zhuǎn)移酶固定在戊二醛活化和NTA磁性微球上。
? 為可溶性和固定化轉(zhuǎn)移酶建立了最佳操作條件。
? 轉(zhuǎn)移酶固定在MagStart-NTA微球上導致最高的活性衍生物。
? 固定在戊二醛修飾載體上會產(chǎn)生最穩(wěn)定和可重復使用的衍生物。
? NMPs的酶促合成是在短反應時間內(nèi)進行的。
核苷酸的酶促合成是化學方法的一種有效且可持續(xù)的化學法替代方案。突變尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶TgUPRT2被選為最佳候選（69.5 IU/mg?1，UMP合成），親和固定到MagStart-NTA-Ni上和戊二醛活化MagStart-NH2上。MagStart-NTA-Ni上（6127 IU / g；92%的保留活動，在 50–60 °C 下穩(wěn)定性提高 3–5 倍）和戊二醛活化MagStart-NH2上（3711 IU / g；27%的保留活動；在50-60°C下穩(wěn)定性提高8-20倍），顯示出最佳的可操作性。此外，重復利用7-10次仍保留70%以上酶活。
酶固定化方法
酶固定化前使用http://biophysics.cs.vt.edu/估算酶的等電點和模擬表面質(zhì)子化情況，以判斷是N末端共價固定化還是賴氨酸殘基的ε-NH2的固定化。
一方面，His標記的TgUPRT2固定在MagStart-NTA-Ni磁珠上。為此，將20μL磁珠懸液（25mg/mL）用200μL結(jié)合緩沖液（80 mM sodium phosphate, pH 8.0, 40 mM imidazole, 1.0 M NaCl）在室溫下平衡20分鐘。隨后，20-60μg純His標記的TgUPRT2 與MagStart-NTA-Ni磁珠混合。將懸浮液在室溫下孵育10-15分鐘。結(jié)合后，用洗滌緩沖液（80 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0, 1.0 M NaCl）洗滌，所得固定化酶 (MNiUPRT21-3)在4°C下儲存。
另一方面，TgUPRT2共價固定在戊二醛活化的MagStart-NH2磁珠上：i） 在 pH 7.5 下進行酶固定化，以促進酶的 N 端與磁珠作用 （MGlUPRT2N） 和 ii） pH 值為 10.5下的酶固定化，以通過去質(zhì)子化的賴氨酸殘基的ε-NH2進行固定化（MGlUPRT2Lys）。為此，將25μL磁珠懸液（20mg/mL）洗滌，然后在不同的結(jié)合緩沖液（50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, or 50 mM sodium borate buffer, pH 10.5）中平衡20分鐘，隨后在室溫下用戊二醛活化4小時。之后，從溶液中磁性捕獲珠子并沖洗以除去未反應的戊二醛分子。之后，100μg純TgUPRT2 與戊二醛活化的微球混合，并將所得混合物在室溫下振蕩下孵育20小時。然后磁收集微珠，用結(jié)合緩沖液沖洗三次，并在3M甘氨酸存在下室溫孵育3小時以阻斷任何殘留的戊二醛殘留物。最后，用50 mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）洗滌磁珠，然后用所得生物催化劑（MGlUPRT2N 和 MGlUPRT2Lys）儲存在4°C。
結(jié)果
MagStart-NTA-Ni磁珠固定化，酶活回收92%。
N末端共價固定在戊二醛活化的MagStart-NH2磁珠上，酶活下降72%。原因是N末端靠近酶活性中心。
賴氨酸殘基的ε-NH2固定在戊二醛活化的MagStart-NH2磁珠上，酶活下降90%。原因是ε-NH2靠近酶活性中心。
固定化酶熱穩(wěn)定性提高，重復使用7-10次，酶活保留70%以上。
參考文獻：
1. Javier Acosta, Kim Nguyen, Robert C. Spitale, Jesús Fernández-Lucas, Taylor-made production of pyrimidine nucleoside-5′-monophosphate analogues by highly stabilized mutant uracil phosphoribosyltransferase from Toxoplasma gondii, Bioresource Technology, Volume 339, 2021, 125649, ISSN 0960-8524,
https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.125649.
2. Jon del Arco, Javier Galindo, Vicente Javier Clemente-Suárez, Amaira Corrales, Jesús Fernández-Lucas, Sustainable synthesis of uridine-5′-monophosphate analogues by immobilized uracil phosphoribosyltransferase from Thermus thermophilus, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, Volume 1868, Issue 1, 2020, 140251, ISSN 1570-9639, https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2019.07.004.
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