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2.1 臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)方法的基礎(chǔ)原理和邏輯基礎(chǔ)

      糖基化后，產(chǎn)生功能性糖蛋白，在生物體系中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，這種修飾過程有時(shí)可能導(dǎo)致特定糖蛋白的異常產(chǎn)生，這些糖蛋白的糖位點(diǎn)和/或糖鏈以病理方式異常改變，從而導(dǎo)致一系列功能變化。糖蛋白質(zhì)組學(xué)的方法涉及幾個(gè)關(guān)鍵步驟：臨床樣本選擇、樣本處理（蛋白質(zhì)提取、酶消化、IGP富集）、LC–MS/MS分析、生物信息學(xué)分析和結(jié)果驗(yàn)證（圖2）。糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析的第一個(gè)關(guān)鍵步驟是確保臨床樣本的質(zhì)量，因?yàn)樗苯佑绊懽罱K結(jié)果。復(fù)雜性更高、異質(zhì)性和糖蛋白濃度較低的臨床樣本在分析上提出了重大挑戰(zhàn)。在樣本處理之后，隔離和/或富集糖蛋白和/或IGP是關(guān)鍵步驟，因?yàn)樘腔呢S度有限。IGP富集的偏好可能存在于不同的富集材料或策略中。這種IGP富集過程通常與LC–MS/MS技術(shù)結(jié)合使用，已成為糖蛋白質(zhì)組研究中深入識(shí)別IGP的重要工具。選擇質(zhì)譜儀和碎裂模式是至關(guān)重要的，因?yàn)殡逆満吞擎溗榱研枰煌乃榱涯芰?。這個(gè)選擇直接影響IGP識(shí)別的準(zhǔn)確性和/或深度。注釋IGP MS/MS譜圖是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，涉及正確分配肽載體、糖位點(diǎn)和附著的糖鏈。已經(jīng)開發(fā)了許多軟件程序和算法（Byonic、MSFraggerGlyco、pGlyco系列、StrucGP等），用于糖蛋白質(zhì)組學(xué)的識(shí)別和定量分析。盡管糖蛋白質(zhì)組學(xué)存在生物信息學(xué)障礙，但一些工具已經(jīng)顯示出卓越的性能和巨大潛力，提供了更敏感、準(zhǔn)確和全面的糖基化信息。此外，基于LC–MS/MS的糖蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)應(yīng)通過額外的方法進(jìn)行驗(yàn)證，如小規(guī)模生化實(shí)驗(yàn)和大規(guī)模隊(duì)列驗(yàn)證。至關(guān)重要的是，應(yīng)通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確認(rèn)糖蛋白的功能作用?？傊?，糖蛋白質(zhì)組學(xué)的復(fù)雜性強(qiáng)調(diào)了解碼糖蛋白及其生物重要性的謎題所需的復(fù)雜性和準(zhǔn)確性。

2.2 臨床樣本選擇

      在進(jìn)行臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)之前，必須仔細(xì)考慮研究的每個(gè)方面，包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、臨床樣本、設(shè)備和軟件。值得注意的是，臨床樣本（人體組織和體液）的選擇顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度（圖2A）。特別是，應(yīng)考慮以下方面：疾病亞型和階段、臨床數(shù)據(jù)、樣本類型、樣本分類、樣本量、收集程序、預(yù)處理方法、存儲(chǔ)條件、運(yùn)輸物流等。例如，Cao等人對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）和正常鄰近組織的胰腺組織樣本進(jìn)行了糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析。他們收集了臨床數(shù)據(jù)，并考慮了不同的組織來源和國(guó)家。對(duì)組織樣本的收集、預(yù)處理、存儲(chǔ)和運(yùn)輸應(yīng)用了標(biāo)準(zhǔn)化。在臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)中，通過穿刺和手術(shù)獲得的生理和病理組織樣本，以及通過臨床檢查獲得的體液（如血液、尿液、精液、眼淚、唾液和CSF）是最常見的來源（圖2A）。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)包括適當(dāng)?shù)膶?duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，確保每個(gè)組中的病例數(shù)量足夠（通常超過30個(gè)），樣本量足夠（通常確保至少提取100 μg蛋白質(zhì)），并最小化不必要的污染。此外，建立標(biāo)準(zhǔn)化的樣本收集、預(yù)處理、存儲(chǔ)和運(yùn)輸協(xié)議對(duì)于有效進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。必須嚴(yán)格遵守這些程序，以確保結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。

2.3 樣本處理

2.3.1 蛋白質(zhì)提取

      臨床樣本處理是糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析的一個(gè)重要瓶頸。為了減少實(shí)驗(yàn)中的干擾，建立一個(gè)針對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)和樣本類型的標(biāo)準(zhǔn)化流程至關(guān)重要。臨床樣本處理的第一步是蛋白質(zhì)提?。▓D2B）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，必須決定是提取所有蛋白質(zhì)還是針對(duì)特定的糖蛋白（如高豐度的免疫球蛋白[Ig]和尿調(diào)節(jié)蛋白）進(jìn)行提取。為了有效權(quán)衡各種提取策略的優(yōu)缺點(diǎn)，我們提出了一個(gè)全面的方法。首先，人們應(yīng)該仔細(xì)優(yōu)化和比較幾種糖蛋白質(zhì)組學(xué)提取技術(shù)，重點(diǎn)關(guān)注提取試劑和所采用的方法。隨后，選擇在大規(guī)模臨床樣本中提取糖蛋白質(zhì)組最有效的方法。最后階段，基于對(duì)特定感興趣糖蛋白的識(shí)別，可以針對(duì)這些目標(biāo)糖蛋白定制提取過程。這種策略確保了在提取過程中平衡效率和特異性，有助于更精確和深入地分析糖蛋白質(zhì)組。此外，提取溶劑和方法的選擇應(yīng)與樣本類型相匹配。例如，在處理最常用的臨床樣本人類血漿時(shí)，去除高豐度蛋白（HAPs）很重要。HAPs占人類血漿總蛋白質(zhì)組的85%，血漿蛋白的濃度跨越了超過10個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍。這些HAPs可能導(dǎo)致質(zhì)譜信號(hào)抑制，限制了低豐度蛋白（LAPs）的檢測(cè)。已經(jīng)開發(fā)了許多方法來簡(jiǎn)化和標(biāo)準(zhǔn)化血漿樣本。免疫基礎(chǔ)的耗竭技術(shù)，如針對(duì)最豐富的兩種或十四種蛋白質(zhì)，以及組合肽配體庫的使用，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用。

       近幾十年來，基于納米技術(shù)樣本處理策略已成為進(jìn)行自動(dòng)化血漿處理和深入蛋白質(zhì)組分析的高效方法。磁性納米粒子（MNs）體積小，比表面積大，親和力位點(diǎn)豐富，允許特異性或非特異性富集蛋白質(zhì)或PTMs（質(zhì)譜前處理試劑盒_生物磁珠專家）。當(dāng)MNs進(jìn)入血漿時(shí)，最初吸附HAPs在納米-血漿界面形成蛋白質(zhì)冠。這些HAPs隨后被具有更高親和力的LAPs所取代。尿液樣本以其臨床收集的便利性、無創(chuàng)性以及能夠提供大量和可持續(xù)的數(shù)量而聞名。然而，尿液蛋白質(zhì)組受到變異性和稀釋的影響，需要在數(shù)據(jù)分析中仔細(xì)考慮標(biāo)準(zhǔn)化程序。許多研究表明，尿液可以作為一系列疾病早期生物標(biāo)志物的寶貴來源。組織樣本通過手術(shù)或穿刺獲得，是探索疾病進(jìn)展分子機(jī)制的重要資源。蛋白質(zhì)提取過程中的均質(zhì)化非常重要，因?yàn)槿魏尾煌耆木|(zhì)化都可能導(dǎo)致關(guān)鍵信息的丟失，從而影響發(fā)現(xiàn)的準(zhǔn)確性和精確性。組織樣本提取的常用方法包括研磨、均質(zhì)化和超聲處理等?；驹韲@最小化蛋白質(zhì)降解，防止污染，并在低溫和裂解液保存的受控環(huán)境中進(jìn)行。

      除了分析復(fù)雜臨床樣本的蛋白質(zhì)組外，通過抗體親和力和凝集素親和力對(duì)目標(biāo)糖蛋白進(jìn)行深入糖基化分析，對(duì)識(shí)別疾病生物標(biāo)志物至關(guān)重要。例如，我們通過固定化蛋白A/G瓊脂糖從人血漿中分離出IgG，并檢查其在各種慢性腎臟疾病（CKDs）中的N-糖基化。此外，我們使用硅藻土粉末從人尿液中提取尿調(diào)節(jié)蛋白，并分析其在IgA腎?。↖gAN）中的N-糖基化?？傊谶x擇蛋白質(zhì)提取方法時(shí)，重要的是要考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆颖绢愋停⒆裱鲜龈攀龅幕驹瓌t。

2.3.2 酶消化

      對(duì)于復(fù)雜臨床樣本中IGP的分析，通常不需要特殊的酶消化要求。通過自下而上的射擊蛋白質(zhì)組學(xué)（Figure 2B）進(jìn)行IGP分析時(shí)，胰蛋白酶是主要使用的酶。然而，當(dāng)分析特定的糖蛋白時(shí)，需要進(jìn)行糖位點(diǎn)預(yù)測(cè)，以選擇適當(dāng)?shù)拿富蛎傅慕M合。例如，重組的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2（SARS-CoV-2）刺突蛋白含有22個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。對(duì)酶切位點(diǎn)的理論分析表明，僅使用胰蛋白酶不能產(chǎn)生足夠長(zhǎng)的肽段以覆蓋所有潛在的N-糖基化位點(diǎn)。為了解決這個(gè)問題，引入了內(nèi)蛋白酶Glu-C來識(shí)別缺失的N-糖基化位點(diǎn)。

      同樣，Watanabe等人分別用胰蛋白酶、糜蛋白酶或α-溶細(xì)胞蛋白酶消化刺突蛋白，以覆蓋所有潛在的N-糖基化位點(diǎn)。肽N-糖苷酶F（PNGase F）是一種來自Elizabethkingia miricola的酶，通過大腸桿菌重組技術(shù)生產(chǎn)。它可以通過裂解幾乎所有類型的N-糖鏈（包括高甘露糖型、混合型和復(fù)雜型糖鏈）連接處的內(nèi)層N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰胺殘基，有效地移除N-糖鏈。因此，PNGase F通常用于識(shí)別N-糖鏈和N-糖基化位點(diǎn)。此外，當(dāng)需要O-糖基化分析時(shí)，使用PNGase F消除N-糖鏈，以最小化對(duì)O-糖鏈檢測(cè)的干擾。缺乏明確的蛋白質(zhì)序列一致性對(duì)于O-糖基化位點(diǎn)的識(shí)別是一個(gè)挑戰(zhàn)。然而，最近發(fā)現(xiàn)一種多功能的O-糖蛋白酶，稱為免疫調(diào)節(jié)金屬蛋白酶來自銅綠假單胞菌。這種酶可以特異性識(shí)別并切割O-糖基化絲氨酸或蘇氨酸殘基附近的糖蛋白，有助于準(zhǔn)確識(shí)別每個(gè)O-糖基化位點(diǎn)的O-糖鏈結(jié)構(gòu)。利用這種創(chuàng)新酶，研究人員在小鼠大腦中識(shí)別了近100個(gè)O-糖蛋白。除了上述特定的蛋白酶外，非特異性蛋白酶也可用于檢測(cè)特定的糖基化。例如，使用非特異性絲氨酸蛋白酶蛋白酶K對(duì)整體蛋白質(zhì)消化很有價(jià)值。使用各種酶及其組合將增強(qiáng)糖位點(diǎn)和糖鏈的全面識(shí)別。

2.3.3 IGP富集

      在臨床樣本中，糖蛋白和IGP的豐度低，加上MS分析期間原生IGP的離子抑制和復(fù)雜的位點(diǎn)特異性異質(zhì)性，為準(zhǔn)確檢測(cè)帶來了挑戰(zhàn)。為了解決這些挑戰(zhàn)，已經(jīng)開發(fā)了各種富集方法來提高M(jìn)S分析期間IGP的可檢測(cè)性和靈敏度。這些方法包括使用特定凝集素進(jìn)行捕獲、基于水合硼酸的捕獲技術(shù)和親和分離策略。最常用的糖蛋白或IGP富集技術(shù)包括凝集素親和色譜法（LAC）、水合硼酸化學(xué)、親水作用液相色譜（HILIC）和水合肼化學(xué)。這些方法已經(jīng)迅速發(fā)展，以提高糖蛋白或IGP的富集效率。表1概述了每種富集方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。LAC已廣泛用于研究具有特殊糖鏈的糖蛋白。凝集素源自植物或動(dòng)物，具有獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)，能夠識(shí)別特定的糖鏈。這一特性使它們成為科學(xué)界幾十年來寶貴的工具，特別是在識(shí)別新的疾病相關(guān)生物標(biāo)志物方面。水合硼酸化學(xué)方法是以其與具有順式1,2和1,3二醇的糖鏈的可逆反應(yīng)而聞名，在堿性條件下形成環(huán)酯，在酸性條件下釋放糖鏈，同時(shí)保持其結(jié)構(gòu)。HILIC方法作為一種新興的分離和富集方法，在糖蛋白質(zhì)組學(xué)中表現(xiàn)出色，因?yàn)樗瞄L(zhǎng)分離IGP和糖鏈。這種技術(shù)利用離子、親水性IGP和相對(duì)疏水的非糖基化肽之間的對(duì)比電性質(zhì)。這種獨(dú)特的配置使HILIC能夠有效地在色譜柱上結(jié)合IGP，促進(jìn)非糖基化肽的去除。水合肼化學(xué)方法用于氧化糖鏈通過水合肼試劑的修飾。它包括氧化、鏈接形成、蛋白水解、同位素標(biāo)記、釋放和隨后分析等一系列步驟。這種高效的方法是探索糖位點(diǎn)的強(qiáng)大手段。

       功能化的MNP方法已被用于富集糖蛋白，擴(kuò)大了磁性納米材料的應(yīng)用范圍。各種納米粒子作為膠囊綁定糖蛋白或IGP。例如，一種名為Fe3O4@mSiO2@G6P的親水性納米材料被特別設(shè)計(jì)用于從辣根過氧化物酶和IgG消化物中捕獲IGP。此外，一種超親水的介孔二氧化硅磁性納米球體，稱為Fe3O4–CG@mSiO2，以其出色的吸附能力、靈敏度、尺寸排除功能、穩(wěn)定性和回收效率而表現(xiàn)出色。這使得它在提取血清外泌體方面非常有效。因此，根據(jù)特定研究要求仔細(xì)選擇合適的富集技術(shù)至關(guān)重要，確保靈敏度、特異性和通量之間的平衡。每種方法都提供了獨(dú)特的特點(diǎn)，解決了糖蛋白分析的各個(gè)方面，從糖蛋白捕獲的準(zhǔn)確性到糖肽回收的有效性。隨著該領(lǐng)域的發(fā)展，這些技術(shù)的改進(jìn)對(duì)于提高我們對(duì)糖蛋白功能及其在多樣生物場(chǎng)景中重要性的理解至關(guān)重要。富集技術(shù)在推進(jìn)糖蛋白質(zhì)組學(xué)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，顯著促進(jìn)了對(duì)糖蛋白和IGP的理解和分析。然而，必須承認(rèn)一個(gè)關(guān)鍵問題：富集過程不可避免地導(dǎo)致糖蛋白或IGP的部分結(jié)構(gòu)或組成完整性的損失，這是由于每種方法的偏好。這種損失在一定程度上可能影響糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析的結(jié)果。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，最近的進(jìn)步集中在開發(fā)聯(lián)合方法上，以更完整或互補(bǔ)的形式分離糖蛋白或IGP，目標(biāo)是提高IGP分析的準(zhǔn)確性和可靠性。

2.4 LC–MS/MS分析

      在開始實(shí)驗(yàn)程序之前，選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒ǎㄙ|(zhì)譜儀、碎裂策略或質(zhì)譜采集方法）對(duì)于獲得有意義的結(jié)果至關(guān)重要（圖2C）。重要的是，質(zhì)譜儀的分辨率和靈敏度在準(zhǔn)確識(shí)別IGP中起著關(guān)鍵作用。利用不同直徑的色譜柱的色譜技術(shù)在這一努力中起著基礎(chǔ)性作用。流速可能受到柱內(nèi)顆粒大小和柱直徑的影響。通常，使用較小直徑的柱子并降低流速可以顯著提高IGP的分離效率。使用與質(zhì)譜兼容的溶劑可以同時(shí)啟動(dòng)超高效或高性能液相色譜（UPLC/HPLC）與質(zhì)譜。此外，反相高效液相色譜（RP-HPLC）技術(shù)因其與電噴霧離子化兼容而得到廣泛應(yīng)用。這種兼容性不僅促進(jìn)了卓越的分離能力，還確保了一致和可重復(fù)結(jié)果的產(chǎn)生。RP-HPLC的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，包括其出色的分離效率和可靠性，強(qiáng)調(diào)了其在分析化學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵作用。

      質(zhì)譜發(fā)展之旅既復(fù)雜又迷人，標(biāo)志著科學(xué)儀器領(lǐng)域的重要里程碑。在出現(xiàn)的各種技術(shù)中，基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）質(zhì)譜因其能夠分析糖鏈組成而脫穎而出。這種技術(shù)因其高通量和高效率而受到贊譽(yù)，成為糖組學(xué)領(lǐng)域的基石。另一方面，LC–MS/MS在檢測(cè)IGP方面具有更多優(yōu)勢(shì)，具有高分辨率和更豐富的糖基化信息。這種復(fù)雜的質(zhì)譜分析過程通過三個(gè)關(guān)鍵步驟展開：電離（將物質(zhì)轉(zhuǎn)化為離子）、質(zhì)量分析（質(zhì)量-電荷比（m/z））和檢測(cè)（質(zhì)量分析器和探測(cè)器），每個(gè)步驟在從樣本到洞察的旅程中都起著至關(guān)重要的作用。在最近的進(jìn)展中，飛行時(shí)間（TOF）和（Orbitrap）質(zhì)譜儀已成為臨床糖蛋白質(zhì)組分析的領(lǐng)跑者。這些技術(shù)提供了增強(qiáng)的靈敏度和精確度，使它們成為解開臨床樣本中復(fù)雜蛋白質(zhì)和糖鏈組成的最佳選擇。

      臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的最新進(jìn)展導(dǎo)致了各種串聯(lián)MS/MS碎裂技術(shù)和質(zhì)譜采集方法（如數(shù)據(jù)非依賴采集[DIA]、數(shù)據(jù)依賴采集[DDA]等）的出現(xiàn)，每種方法都因其產(chǎn)生的不同光譜信息和復(fù)雜性而提供了對(duì)糖蛋白復(fù)雜世界的獨(dú)特見解。在這些方法中，逐步碰撞能量/高能量碰撞解離（sceHCD）、電子轉(zhuǎn)移/高能量碰撞解離（EThcD）以及EThcD和sceHCD（EThcD–sceHCD）的組合方法代表了臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)中特別有價(jià)值的方法。sceHCD，作為N-糖蛋白質(zhì)組學(xué)中最常用的技術(shù)，能夠從單一光譜分析中產(chǎn)生來自完整N-糖肽的糖鏈和肽鏈的豐富片段離子。然而，當(dāng)單個(gè)序列中存在多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)時(shí)，其在提供識(shí)別N-糖基化位點(diǎn)確切位置和N-糖鏈特定組成的清晰光譜證據(jù)方面的能力是有限的。此外，sceHCD不是分析O-糖蛋白質(zhì)組學(xué)的首選方法。相比之下，EThcD已成為一種更有效的完整O-糖肽碎裂方法，因?yàn)樗軌虍a(chǎn)生與糖鏈相連的c/z離子，這不僅有助于鑒定肽鏈，還有助于推斷糖基化位點(diǎn)的位置及其糖鏈組成。這種尖端方法顯著提高了識(shí)別O-糖基化位點(diǎn)的精度，這一點(diǎn)通過檢測(cè)到的片段離子的多樣性和數(shù)量的增加得到了證明。盡管技術(shù)進(jìn)步，但在提高EThcD的效率以更廣泛地應(yīng)用于糖蛋白質(zhì)組學(xué)方面仍存在挑戰(zhàn)。在我們最近的研究中，我們引入了一種創(chuàng)新的混合解離方法，EThcD–sceHCD，它結(jié)合了EThcD和sceHCD的優(yōu)勢(shì)。這種整合在糖蛋白質(zhì)組工作流程中形成了一個(gè)強(qiáng)大的工具，利用兩種技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。 我們的發(fā)現(xiàn)表明，EThcD–sceHCD顯著增強(qiáng)了對(duì)臨床樣本中復(fù)雜糖蛋白的分析，如高度糖基化的人類免疫缺陷病毒（HIV）-1 gp120蛋白和Ig。與傳統(tǒng)方法相比，僅依賴EThcD或sceHCD，這種混合方法表現(xiàn)出更優(yōu)越的性能。它提供了更高質(zhì)量的光譜數(shù)據(jù)，產(chǎn)生了更詳細(xì)的片段離子信息，并識(shí)別了更多的完整N/O-糖肽。這些進(jìn)展強(qiáng)調(diào)了EThcD–sceHCD推動(dòng)糖蛋白質(zhì)組研究邊界的潛力，為臨床樣本中的糖蛋白提供了更全面和深入的分析。

      多樣的碎裂技術(shù)在推進(jìn)我們對(duì)健康和疾病中涉及的功能性糖蛋白的理解中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這種多樣性使研究人員能夠發(fā)現(xiàn)統(tǒng)一方法無法提供的深入見解。隨著我們深入研究這些MS/MS技術(shù)的能力，它們對(duì)臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)的顯著貢獻(xiàn)預(yù)計(jì)將豐富我們的理解和為新的研究和臨床應(yīng)用鋪平道路。盡管如此，數(shù)據(jù)處理，特別是完整N/O-糖肽MS/MS數(shù)據(jù)的注釋，仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。這包括準(zhǔn)確識(shí)別糖鏈組成和結(jié)構(gòu)、糖位點(diǎn)和肽鏈骨架。因此，開發(fā)專門的軟件和生物信息學(xué)工具非常重要。

2.5 生物信息學(xué)分析

      精確的分析軟件致力于解碼質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用先進(jìn)的算法。這些算法專門設(shè)計(jì)用于分析IGP的獨(dú)特特征，重點(diǎn)關(guān)注提高計(jì)算速度和效率。目前，這些軟件工具主要關(guān)注分析完整的N/O-糖肽，這與不同疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)?；诤诵乃惴ǖ淖兓?，這些軟件工具主要分為肽優(yōu)先搜索（如Byonic、MSFraggerGlyco等）和糖鏈優(yōu)先搜索（pGlyco系列）。對(duì)他們的進(jìn)展、原理和獨(dú)特特征進(jìn)行了全面的綜述。Byonic被廣泛認(rèn)為是分析IGP質(zhì)譜數(shù)據(jù)的商業(yè)軟件。該軟件配備了N-糖鏈和O-糖鏈庫以及目標(biāo)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，可以自動(dòng)搜索以識(shí)別糖蛋白、糖位點(diǎn)和糖鏈組成。該軟件已有效用于分析HeLa細(xì)胞中表達(dá)的單個(gè)糖蛋白的獨(dú)特N-糖基化模式，以及尿液糖蛋白質(zhì)組的O-糖基化譜。

      MSFragger-Glyco首次引入了開放和質(zhì)量偏移搜索策略。該軟件能夠通過區(qū)分復(fù)雜情況下糖肽片段的能量水平來評(píng)估混合糖蛋白的能量。因此，它可以分析目標(biāo)糖肽（能量更高），而忽略糖鏈片段（能量更低），從而減少錯(cuò)誤。MSFragger-Glyco在解碼多種復(fù)雜的N-糖蛋白質(zhì)組和O-糖蛋白質(zhì)組方面表現(xiàn)出色。O-Pair搜索是為分析O-糖基化數(shù)據(jù)而設(shè)計(jì)的第一個(gè)算法。該方法最初使用離子索引的開放搜索與HCD譜圖快速識(shí)別肽和O-糖鏈質(zhì)量的配對(duì)。61圖形理論方法基于EThcD譜圖中存在的離子定義位點(diǎn)特異性O(shè)-糖鏈定位，然后通過磷酸化RS算法的擴(kuò)展進(jìn)行定位概率計(jì)算。這個(gè)算法主要用于定位磷酸化位點(diǎn)，確定假發(fā)現(xiàn)率（FDR），并識(shí)別未修飾的肽鏈。GlycoPeptide Finder（GP Finder）專門開發(fā)用于識(shí)別廣泛的糖位點(diǎn)。通過分析非特異性蛋白酶消化產(chǎn)生的N-和O-糖肽數(shù)據(jù)，可以在保持5% FDR的同時(shí)計(jì)算消化后肽序列的總體概率。這個(gè)工具不僅能夠分析單個(gè)蛋白質(zhì)和單個(gè)糖位點(diǎn)，還能夠分析未知蛋白質(zhì)混合物。StrucGP專注于識(shí)別完整的N-糖肽。它首先通過N-糖鏈的Y離子模式識(shí)別肽鏈組分，然后努力通過預(yù)定義的子結(jié)構(gòu)模板解釋糖鏈結(jié)構(gòu)。此外，它在糖鏈識(shí)別后還包括糖鏈級(jí)別的質(zhì)量控制措施。

      pGlyco系列軟件作為第一個(gè)能夠在糖鏈、肽鏈和IGP水平進(jìn)行質(zhì)量控制的搜索引擎，顯著提高了準(zhǔn)確性并加快了IGP匹配。上述提到的軟件工具大大提高了識(shí)別完整N-糖肽和O-糖肽的精度。然而，IGP定量分析的軟件工具仍然存在差距。pGlycoQuant通過使用深度學(xué)習(xí)模型來最小化缺失值，在IGP匹配方面取得了顯著進(jìn)展。PANDA軟件采用多項(xiàng)式展開技術(shù)計(jì)算肽元素的自然分布，從而推導(dǎo)出同位素峰的理論相對(duì)豐度。隨后，通過在用戶定義的誤差容忍度內(nèi)匹配同位素峰的理論位置，從MS1譜圖中提取觀察到的同位素強(qiáng)度。

      上述進(jìn)展顯著增強(qiáng)了流行的搜索引擎如pGlyco3、Byonic和MSFraggerGlyco的定量能力。然而，這些軟件工具仍然面臨許多需要解決的挑戰(zhàn)。理想的軟件應(yīng)與各種質(zhì)譜采集方法、不同的碎裂模式、N-和O-糖鏈庫以及不同物種的蛋白質(zhì)庫兼容。開發(fā)能夠有效解碼新糖鏈的糖鏈數(shù)據(jù)庫獨(dú)立工具至關(guān)重要。能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)來源的IGP進(jìn)行定性和定量分析的軟件的創(chuàng)建，將極大地增強(qiáng)臨床應(yīng)用和臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)的轉(zhuǎn)化?？偟膩碚f，當(dāng)前的軟件工具正在朝著實(shí)現(xiàn)更全面的IGP分析、提高準(zhǔn)確性和靈活性的方向發(fā)展。

2.6 結(jié)果驗(yàn)證

      基于質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)組學(xué)使我們能夠在疾病和對(duì)照樣本中發(fā)現(xiàn)數(shù)千種差異表達(dá)的糖蛋白、IGP、糖位點(diǎn)和糖鏈。然而，很少有候選糖生物標(biāo)志物在臨床研究中得到測(cè)試。這種現(xiàn)象可以歸因于糖蛋白質(zhì)組學(xué)方法的不成熟、缺乏質(zhì)量控制、假陽性檢測(cè)、小的臨床樣本量、缺乏定量和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以及在驗(yàn)證和臨床應(yīng)用中的挑戰(zhàn)。因此，研究人員應(yīng)逐漸開始通過必要的結(jié)果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)，類似于臨床蛋白質(zhì)組學(xué)，盡管存在挑戰(zhàn)。如圖2E所示，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)包括分子、細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。通過這些實(shí)驗(yàn)，可以詳細(xì)了解蛋白質(zhì)和糖鏈的結(jié)構(gòu)和功能。此外，糖蛋白生物標(biāo)志物的驗(yàn)證應(yīng)該進(jìn)行回顧性和前瞻性，采用多中心獨(dú)立樣本驗(yàn)證方法。驗(yàn)證結(jié)果的無偏見性是最終評(píng)估糖蛋白生物標(biāo)志物性能的關(guān)鍵。

      總的來說，臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)的方法包括上述幾個(gè)程序（臨床樣本選擇、樣本處理、LC–MS/MS分析、生物信息學(xué)分析和結(jié)果驗(yàn)證）。這些方法不斷改進(jìn)，以提高結(jié)果的質(zhì)量，使我們能夠更深入地理解疾病的糖蛋白質(zhì)組學(xué)病理生理學(xué)。然而，需要注意的是，這些方法仍然面臨挑戰(zhàn)，如無意中選擇不適當(dāng)?shù)臉颖尽⑹謩?dòng)實(shí)驗(yàn)過程、不適當(dāng)?shù)腗S方法、有限的生物信息學(xué)工具和不確定的驗(yàn)證結(jié)果。重要的是，只有高質(zhì)量的樣本、標(biāo)準(zhǔn)化的樣本處理以及可靠的測(cè)量和分析，才對(duì)確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可靠性有價(jià)值。通過解決這些障礙，臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)可以繼續(xù)為我們理解疾病做出重要貢獻(xiàn)。

圖2：糖蛋白組學(xué)分析的基本流程