利用免疫磁性試紙條高靈敏度定量檢測(cè)血液的研發(fā)
在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自俄羅斯科學(xué)院基礎(chǔ)物理研究所(General Physics Institute of the Russian Academy of Sciences, GPI RAS)和莫斯科物理技術(shù)學(xué)院(Moscow Institute of Physics and Technology, MIPT)的研究人員開(kāi)發(fā)出一種新的基于磁性納米顆粒的生物傳感器測(cè)試系統(tǒng)。它能夠高度準(zhǔn)確地測(cè)量包括不透明液體或較濃顏色液體在內(nèi)的多種樣品中的蛋白分子濃度。相關(guān)研究將發(fā)表在2015年5月15日那期Biosensors and Bioelectronics期刊上，論文標(biāo)題為“Rapid dry-reagent immunomagnetic biosensing platform based on volumetric detection of nanoparticles on 3D structures”。
這種新開(kāi)發(fā)的測(cè)試系統(tǒng)類(lèi)似于早孕測(cè)試。利用由多孔材料制成的含有一條測(cè)試線(test line)和控制線(control line)的小型試紙條就可進(jìn)行分析。一滴液體樣品加在試紙條的一端上，在較短時(shí)間后，分析結(jié)果可根據(jù)控制線或測(cè)試線和控制線的顯色反應(yīng)而呈現(xiàn)出來(lái)。這些試紙條在使用前可長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存著。這種測(cè)試快速進(jìn)行，也不需要由經(jīng)過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的人員來(lái)執(zhí)行；測(cè)試可在病人旁邊或者甚至在戶外條件下輕松完成。
在分子水平上，這種磁性納米顆粒與特異性結(jié)合到靶蛋白的抗體偶聯(lián)在一起，然后將它們放置在事先確定好的試紙條加樣位點(diǎn)附近的多孔纖維素膜上。這種液體樣品在毛細(xì)管作用下沿著這種纖維素膜側(cè)向擴(kuò)散，并捕獲磁性納米顆粒。它接著遇見(jiàn)測(cè)試線和控制線。測(cè)試線含有能夠捕獲靶蛋白的檢測(cè)抗體(test antibody)，通過(guò)雙抗夾心方法，這種檢測(cè)抗體也能捕獲與靶蛋白抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒。如圖2所示?？刂凭€含有控制抗體(control antibody)，該控制抗體僅捕獲與磁性納米顆粒偶聯(lián)的抗體，只要測(cè)試條可以使用，那么控制線在任何情況下都會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)。因此，控制線可用來(lái)指示這項(xiàng)測(cè)試是否可靠、它的蛋白抗體是否因儲(chǔ)存錯(cuò)誤而被破壞，以及測(cè)試液體是否正確地加入到試紙條中。
在樣品浸潤(rùn)試紙條以及抗體彼此發(fā)生反應(yīng)之后，就能夠讀取測(cè)試結(jié)果。這確實(shí)類(lèi)似于早孕測(cè)試中的步驟。在經(jīng)典的早孕測(cè)試中，測(cè)試結(jié)果是“Yes”或“No”。然而，針對(duì)這種新的測(cè)試方法而言，研究人員不僅能夠高靈敏地檢測(cè)蛋白，而且能夠確定這種蛋白的濃度。測(cè)定這種濃度的準(zhǔn)確性甚至超過(guò)了專業(yè)人員僅在實(shí)驗(yàn)室條件下才能進(jìn)行的測(cè)試方法的準(zhǔn)確性。
論文通信作者Alexey Orlov說(shuō)，“在正常情況下，利用熒光或顏色標(biāo)志物，測(cè)試不僅能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下執(zhí)行，也能夠在戶外條件下開(kāi)展，檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)目測(cè)或者攝像機(jī)加以確定。就我們的這項(xiàng)研究而言，我們使用磁性顆粒，其顯著優(yōu)勢(shì)在于：即便試紙條上滴入完全不透明的液體（如全血樣品），它們也能被用來(lái)確定全血樣品中的物質(zhì)。利用一種可攜帶的設(shè)備可完全通過(guò)電子學(xué)方法進(jìn)行準(zhǔn)確地定量測(cè)定。這完全排除了任何不明確的地方?！?br />
研究人員注意到，除了高靈敏地檢測(cè)蛋白濃度外，這種新的測(cè)試系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)測(cè)量范圍更廣：測(cè)試濃度上限是下限的4000多倍。
這種新的測(cè)試系統(tǒng)可被用來(lái)測(cè)量血液中的最低濃度為0.025ng/ml的前列腺特異性抗原(PSA)。PSA是臨床男性篩查中最常用的檢測(cè)標(biāo)志物之一。健康的PSA濃度低于4ng/ml。
PSA是前列腺癌的潛在標(biāo)志物之一，而且它在法醫(yī)學(xué)上也被用來(lái)檢測(cè)精液痕跡。這兩項(xiàng)應(yīng)用具有一些局限性，它們不能夠決定性地診斷或證實(shí)嫌疑人的罪行，但是這種新的傳感器檢測(cè)平臺(tái)將不只是分析PSA；之所以選擇這種特殊的蛋白進(jìn)行研究是為了證實(shí)這種方法的確可行。
測(cè)定PSA的靈敏度要足以確定前列腺移除后是否會(huì)復(fù)發(fā)，以及所獲得的結(jié)果應(yīng)當(dāng)有助于開(kāi)發(fā)潛在的療法。它不僅能夠判斷一種特定的標(biāo)志物是否超出正常范圍，而且也能夠用來(lái)輕松地追蹤疾病中蛋白標(biāo)志物濃度的動(dòng)態(tài)變化。
為了驗(yàn)證這種新方法的測(cè)試結(jié)果，研究人員利用了作為金標(biāo)準(zhǔn)方法的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行測(cè)量，并進(jìn)行比較，結(jié)果證實(shí)這種新的測(cè)試系統(tǒng)工作非常良好，而且比傳統(tǒng)方法更有顯著優(yōu)勢(shì)。
在這項(xiàng)新的測(cè)試系統(tǒng)中，研究人員利用他們自己的專利方法---磁性顆粒定量(magnetic particle quantification, MPQ)---先進(jìn)行非線性磁化，然后準(zhǔn)確地對(duì)磁性納米顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)。利用這種方法，研究人員能夠記錄最低至60×10-21摩爾的磁性納米顆粒，并且線性范圍超過(guò)1000萬(wàn)倍。在此之前，還從沒(méi)有在這種水平上記錄到這些參數(shù)。這種方法涉及給磁性納米顆粒施加兩種頻率交替變化的磁場(chǎng)，并監(jiān)控在組合頻率下的感應(yīng)反應(yīng)。
很多分析物質(zhì)的方法是基于測(cè)試對(duì)象(不論是顆粒還是分子)受到電磁場(chǎng)的影響。在適當(dāng)?shù)念l率下，樣品開(kāi)始積極地吸收輻射，或者作為響應(yīng)，發(fā)出輻射。在這項(xiàng)研究中，研究人員使用磁場(chǎng)的兩種頻率組合，并監(jiān)控這兩種頻率線性組合所產(chǎn)生的頻率---也被稱作組合頻率(combinatorial frequency)---下的反應(yīng)。
MIPT納米生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室主管Maxim Nikitin說(shuō)，“我們之前在美國(guó)芝加哥大學(xué)研究人員的一個(gè)合作項(xiàng)目中已證實(shí)這種檢測(cè)磁性顆粒方法的高靈敏度。我們使用我們的傳感器在動(dòng)物體內(nèi)記錄基于同位素59Fe的放射性磁性納米顆粒(參見(jiàn)發(fā)表在Journal of Applied Physics期刊上的標(biāo)題為“Quantitative real-time in vivo detection of magnetic nanoparticles by their nonlinear magnetization”的論文，doi: 10.1063/1.2830947)。特別地，我們也已發(fā)現(xiàn)這種電子方法的檢測(cè)閾值與伴隨的γ射線輻射的報(bào)道閾值相一致，這意味著在許多生物物理研究中，磁性納米顆粒能夠替換放射性標(biāo)志物。在當(dāng)前的研究中，我們使用這種方法實(shí)現(xiàn)免疫檢測(cè)時(shí)的超高靈敏度?！睆尼t(yī)生角度來(lái)看，磁性納米顆粒明顯更好地用于診斷研究，因?yàn)檫@可防止病人遭受過(guò)量放射性輻射。
GPI RAS實(shí)驗(yàn)室主管和研發(fā)負(fù)責(zé)人Petr Nikitin博士(1979年從MIPT畢業(yè))說(shuō)，“所開(kāi)發(fā)的磁性方法和對(duì)試紙條上的納米標(biāo)志物(即與抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒)進(jìn)行計(jì)數(shù)的記錄儀不僅提供抗原濃度測(cè)量的檢測(cè)極限和范圍，而且它們也能夠有效地控制檢測(cè)過(guò)程的全部階段：從免疫檢測(cè)程序的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化，到執(zhí)行免疫檢測(cè)和判讀檢測(cè)結(jié)果。特別地，這是通過(guò)定量監(jiān)控生化反應(yīng)期間納米標(biāo)志物沿著試紙條的三維多孔纖維素膜(如前面提及的多孔纖維素膜)的再分布而實(shí)現(xiàn)的。再者，用來(lái)合成這些磁性納米顆粒的鐵鹽相對(duì)而言更容易獲得，也比用來(lái)合成金納米顆粒的試劑更加便宜，其中金納米顆粒常用于諸如早孕測(cè)試之類(lèi)的閾值測(cè)試中?！?br />
這種新方法的可靠性、易獲得性、高準(zhǔn)確性和高靈敏度意味著它可能從實(shí)驗(yàn)室原型快速轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢源笠?guī)模產(chǎn)生的產(chǎn)品。這種方法的開(kāi)發(fā)者迄今為止還給出具體的時(shí)間表，但是他們強(qiáng)調(diào)他們的測(cè)試系統(tǒng)不僅可用來(lái)診斷疾病，而且也能夠用于許多其他方面的應(yīng)用。這種測(cè)試系統(tǒng)能夠分析食品產(chǎn)品和藥物；它也能夠用于環(huán)境監(jiān)控。它能夠在現(xiàn)場(chǎng)自行完成全部檢測(cè)過(guò)程，而且也不需要任何復(fù)雜或昂貴的設(shè)備。
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