漫談核酸的提取和純化之三：質(zhì)粒DNA的提取與純化
第三節(jié) 質(zhì)粒DNA的提取與純化
大多數(shù)質(zhì)粒都是雙鏈的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒（CCC plasmid）DNA，簡稱閉環(huán)質(zhì)粒（closed circular plasmid，CC plasmid）。作為攜帶外源基因在細菌中擴增或表達的重要載體（vector），質(zhì)粒在基因工程中應(yīng)用十分廣泛。有關(guān)質(zhì)粒的提取與純化是必須掌握的基本技術(shù)。
一、提取與純化的方法
質(zhì)粒DNA的提取與純化的方法很多，經(jīng)典的方法包括堿裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。這些方法主要由細菌的培養(yǎng)（質(zhì)粒DNA的擴增）、細菌的裂解（質(zhì)粒DNA的釋放）及質(zhì)粒DNA的分離與純化等三個步驟組成。按制備量的不同，質(zhì)粒DNA提取與純化的方法可分為質(zhì)粒DNA的小量（1ml～2ml）制備、質(zhì)粒DNA的中量（20ml～50ml）制備及質(zhì)粒DNA的大量（500ml）制備。
（一）堿裂解法
堿裂解法簡單、重復(fù)性好而且成本低，是使用最廣泛的方法。在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）條件下，用強陽離子去垢劑SDS破壞細胞壁，裂解細胞，與NaOH共同使宿主細胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。盡管堿液能破壞核酸的堿基配對，但CCC質(zhì)粒DNA因纏結(jié)緊密而不會解鏈。只要不在堿性條件下變性太久，當(dāng)pH調(diào)至中性時，CCC質(zhì)粒DNA就可重新恢復(fù)其天然狀態(tài)。裂解后，細胞壁碎片與變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成大的復(fù)合物，這些復(fù)合物在高鉀鹽條件下，可有效沉淀，而質(zhì)粒DNA保留于上清中。直接通過無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，并用70%的乙醇洗滌，其純度可滿足DNA測序與PCR等實驗的要求。
堿裂解法是一種適用范圍很廣的方法，能從所有的大腸桿菌（E.coli）菌株中分離出質(zhì)粒DNA，制備量可大可小。
（二）煮沸裂解法
煮沸裂解法是將細菌懸浮于含Triton X-100和溶菌酶的緩沖液中，Triton X-100和溶菌酶破壞細胞壁后，沸水浴裂解細胞的同時可破壞DNA鏈的堿基配對，并使宿主細胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA變性，但CCC質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會解鏈。當(dāng)溫度下降后，CCC質(zhì)粒DNA可重新恢復(fù)其超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清中的質(zhì)粒DNA。
煮沸裂解法是一種條件比較劇烈的方法，對于大質(zhì)粒（>15kb）有明顯的剪切作用，故只能用于小質(zhì)粒DNA（<15kb）的制備。該法能用于小質(zhì)粒DNA的小量與大量制備，并且適用于大多數(shù)的E.coli菌株。由于糖類很難去除，而且糖抑制限制性酶和聚合酶的活性，故該法不適用于在去污劑、溶菌酶和加熱情況下可釋放大量糖類的E.coli菌株，如HB101及其衍生菌株（TG1）。另外，煮沸不能完全滅活核酸內(nèi)切酶A（endonuclease A，endA）的活性，故表達endA的菌株亦不適用于本法。在細菌培養(yǎng)過程中，加入氯霉素可抑制細菌的蛋白合成和細菌分裂，有利于質(zhì)粒DNA的選擇性擴增。
（三）SDS裂解法
大于15kb的質(zhì)粒DNA容易因細胞裂解和后繼操作而遭到破壞，因此需要溫和的裂解方法。SDS裂解法是將細菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細胞壁，去壁細菌再用SDS裂解，從而溫和地釋放質(zhì)粒DNA到等滲液中，然后用酚/氯仿抽提。
由于條件溫和，SDS裂解法有利于大質(zhì)粒DNA的提取。但該法在處理過程中，有一部分質(zhì)粒DNA因纏結(jié)在細胞碎片上而丟失，故產(chǎn)率不高。
（四）其它方法
其它方法如小量一步提取法、牙簽少量制備法及Triton-溶菌酶法等，各有特點與適用范圍。小量一步提取法，直接將酚/氯仿與細菌培養(yǎng)物混合，同時完成細胞裂解與蛋白質(zhì)變性兩個過程，然后離心去除大部分胞核DNA與蛋白質(zhì)，最后從上清中回收質(zhì)粒DNA。該法簡單快速、經(jīng)濟可行，可用于內(nèi)切酶圖譜分析。
（五）質(zhì)粒DNA的純化
目前，關(guān)于純化的方法與方案非常多，都利用了質(zhì)粒相對較小和共價閉環(huán)的結(jié)構(gòu)特點。其中，純化效果好而且適用范圍廣的方法主要有氯化銫-溴化乙錠等密度梯度超速離心法（簡稱CsCl-EB法）、聚乙二醇沉淀法和柱層析法。
1．CsCl-EB法 CsCl-EB法是一種沉降平衡離心法，經(jīng)超速離心，離心介質(zhì)CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過量EB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開。其中蛋白質(zhì)密度?。?/span>1.3 g/cm3～1.4g/cm3），浮于液面；RNA密度大（2.0g/cm3），沉于管底；各種DNA密度介于蛋白質(zhì)與RNA之間，處于中部。過量EB處理前，細菌染色體DNA與不同分子構(gòu)型的質(zhì)粒DNA的密度均為1.7g/cm3左右，難以區(qū)分。經(jīng)過量EB處理后，不同分子構(gòu)型的DNA與EB的結(jié)合能力不一樣，因而密度下降不一致，可有效分離。其中，閉環(huán)質(zhì)粒DNA為超螺旋三級結(jié)構(gòu)，EB不易插入，結(jié)合量少，密度下降小，約為1.59 g/cm3；而染色體DNA、開環(huán)質(zhì)粒DNA以及帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降較多，約為1.54 g/cm3，從而能與閉環(huán)質(zhì)粒DNA分開?；厥盏拈]環(huán)質(zhì)粒DNA含有嵌入的EB，可采用有機溶劑抽提法或離子交換層析加以去除。經(jīng)典的CsCl-EB法由于其容量大、分辨率高、純化效果好，至今仍是質(zhì)粒DNA純化的標準方法。但該法很費時并需要昂貴的設(shè)備與試劑。
2．聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀法是一種分級沉淀法。質(zhì)粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA，并用RNase消化小分子RNA；然后在高鹽條件下，用PEG選擇性地沉淀大的質(zhì)粒DNA；沉淀的質(zhì)粒DNA進一步用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。該法簡單、經(jīng)濟、適用廣，尤其對堿裂解法提取的質(zhì)粒純化效果好，適用于分子克隆中所有常規(guī)的酶學(xué)反應(yīng)，也能用于高效的哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染。但PEG法不能有效分離帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA與閉環(huán)質(zhì)粒DNA。
3．柱層析法 柱層析法純化質(zhì)粒DNA的關(guān)鍵是其填充的樹脂。大體上，樹脂可分為兩類：一類是利用疏水的相互作用來純化質(zhì)粒DNA樣品；一類則通過離子交換與吸附的相互作用進行純化。以硅基質(zhì)作為填充材料的柱層析，其作用原理是在多鹽條件下，依靠DNA與硅基質(zhì)的可逆性結(jié)合來進行純化。多鹽造成磷酸二酯骨架的脫水，通過暴露的磷酸鹽殘基，DNA吸附到硅基質(zhì)上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖類等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA分子重新水合，并通過離心洗脫出來。DNA與硅基質(zhì)的吸附作用與DNA的堿基組成和拓撲結(jié)構(gòu)無關(guān)，因此可用于環(huán)型質(zhì)粒DNA和線性DNA的純化。小于100bp～200bp的DNA分子由于與硅基質(zhì)的吸附力很弱，不能用于小分子DNA片段的純化。但在純化大分子DNA時，可有效去除小分子DNA的污染。
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