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第四節(jié)        RNA的分離與純化

包括Northern雜交在內(nèi)的許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)均是以RNA為材料，mRNA的制備也需要一定質(zhì)量的總RNA樣品，RNA的數(shù)量、純度與完整性將直接影響這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

RNA中rRNA的數(shù)量最多，占總量的80%～85%；tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%～20%；mRNA僅占1%～5%。由于各種rRNA、tRNA及核內(nèi)小分子RNA的結(jié)構(gòu)與功能已比較清楚，從基因克隆、表達(dá)與診斷的目的出發(fā)，目前對(duì)RNA的分離與純化，主要集中在總RNA與mRNA上。

一、RNA制備的條件與環(huán)境

為防止RNase對(duì)RNA 的水解，一要全力避免細(xì)胞外RNase的污染并抑制其活性，二要盡快地抑制細(xì)胞內(nèi)RNase的活性并極力地去除RNase。對(duì)廣泛存在的細(xì)胞外RNase，應(yīng)在RNA制備的全過程中保持高度的警惕，并采取嚴(yán)格的措施以避免其污染和抑制其活性。

從RNA提取的初始階段開始，就選擇性地使用針對(duì)RNase的蛋白質(zhì)變性劑（如酚、氯仿等有機(jī)溶劑以及強(qiáng)烈的胍類變性劑）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能與蛋白質(zhì)結(jié)合的陰離子去污劑（如SDS、sarkosyl或脫氧膽酸鈉等）并聯(lián)合使用RNase的特異性抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對(duì)RNA的水解。另外，在變性液中加入β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）等還原劑可以破壞RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。

二、總RNA的分離與純化

由于RNase的影響，為獲得完整的RNA分子，就必須在總RNA分離純化的最初階段，盡可能快地滅活胞內(nèi)RNase的活性。在β-巰基乙醇的協(xié)同作用下，高濃度的(異)硫氰酸胍可以極大極快地抑制RNase的活性，能從胰腺等富含RNase的組織細(xì)胞中分離出完整的RNA分子，目前已成為常規(guī)使用的試劑。pH8.0的Tris飽和酚用于DNA的制備，但在RNA純化時(shí)，應(yīng)使用pH4.5～5.5的水飽和酸性酚，這既有利于DNA的變性又有利于RNA的分離。盡管對(duì)剪切力不敏感，但RNA具有堿易變性，需要嚴(yán)格控制pH值。另外，在DNA與RNA的提取過程中，酚與氯仿經(jīng)常結(jié)合、交替使用，主要在于兩者合用時(shí)去除蛋白的效果更好，而且氯仿還能有效抑制RNase的活性，通過使酚脫水防止mRNA的丟失，加速有機(jī)相與水相的分層，去除植物色素和蔗糖以及核酸樣品中的痕量酚。少量異戊醇的加入，其目的在于消除抽提過程中因蛋白質(zhì)變性而產(chǎn)生的泡沫。由于高濃度胍類的使用，為防止SDS的沉淀，常改用十二烷基肌氨酸鈉。對(duì)含量較低的樣品，加入糖原可以提高RNA的回收率。

總RNA提取法中最常使用的是一步法。需要指出的是，目前常用的一步法均以異丙醇沉淀RNA，由于其選擇性地沉淀大分子rRNA和mRNA，故提取的總RNA中含有的小分子量RNA較少，rRNA和mRNA所占的比例相應(yīng)增高。當(dāng)然，目前的研究重點(diǎn)不是小分子量RNA，而是分子量較高的mRNA，不必苛求真正的總RNA。

（一）(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法

(異)硫氰酸胍-酚氯仿法是經(jīng)典的一步法，由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。它以含4mmol/L的(異)硫氰酸胍與0.1mmol/L的β-巰基乙醇的變性溶液裂解細(xì)胞，然后在pH4.0的酸性條件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌來制備RNA。該法與以前的(異)硫氰酸胍-CsCl超速離心法相比，具有簡便、經(jīng)濟(jì)和高效的特點(diǎn)，能同時(shí)迅速地處理多個(gè)標(biāo)本，且RNA的完整性與純度均很高。目前仍用于從培養(yǎng)細(xì)胞和大多數(shù)動(dòng)物組織中分離純化總RNA?？?/span>RNA的產(chǎn)量取決于標(biāo)本的起始量，每毫克組織總RNA的產(chǎn)量大約為4～7mg，每10⁶個(gè)細(xì)胞大約為5～10mg。但該法不適合從富含甘油三酯的脂肪組織中提取RNA，而且有時(shí)RNA會(huì)帶有多糖和蛋白多糖的污染，這些污染將影響乙醇沉淀后RNA的溶解，同時(shí)抑制RT-PCR反應(yīng)，并通過結(jié)合到膜上而影響RNA雜交中的印跡步驟。脂肪組織RNA的提取可換用(異)硫氰酸胍-CsCl超速離心法。當(dāng)多糖與蛋白多糖的污染比較嚴(yán)重時(shí)，可下一個(gè)方法，通過增加一個(gè)有機(jī)溶劑的抽提步驟并改變RNA的沉淀?xiàng)l件而加以消除。

（二）可同時(shí)制備RNA、DNA與蛋白質(zhì)的一步法

該法是(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改進(jìn)方法。它是以(異)硫氰酸胍-酚的單相裂解試劑裂解細(xì)胞，然后加入氯仿后形成兩相。變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相的界面，保留于上層水相的RNA在RNA沉淀溶液中通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌進(jìn)行制備。其中RNA沉淀溶液的成分為1.2mmol/L的NaCl與0.8mmol/L的檸檬酸二鈉。由于RNA沉淀溶液的使用，該法制備的RNA樣品極少有多糖與蛋白多糖的污染，可用于mRNA的純化、Northern雜交、逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR反應(yīng)等。處于界面的DNA與蛋白質(zhì)可通過乙醇和異丙醇分別分級(jí)沉淀出來。該法制備的DNA，大小約為20kb，可作PCR反應(yīng)的模板，蛋白質(zhì)樣品則主要用于免疫印跡。目前，該法已有多種商品化的單相裂解試劑供選擇，是最常用的總RNA提取法，其產(chǎn)率與(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法相當(dāng)。

（三）其它方法

RNA的分離純化方法與方案還有許多，如(異)硫氰酸胍-CsCl超速離心法、鹽酸胍-有機(jī)溶劑法、LiCl-尿素法、熱酚法等，因各種原因目前已較少使用。使用purimag磁珠在分離各種不同樣本的RNA均表現(xiàn)優(yōu)異，更多核酸提取磁珠請(qǐng)參考普瑞邁格官方網(wǎng)站。

三、mRNA的分離與純化

與大小和序列明確的rRNA、tRNA及核內(nèi)小分子RNA不同，真核生物的mRNA在細(xì)胞中含量少、種類多、分子量大小不一。除血紅蛋白及某些組蛋白外，絕大多數(shù)mRNA在其3'末端帶有一個(gè)長短不一的多聚腺苷酸（polyadenylic acid）的結(jié)構(gòu)，即poly(A)尾巴。以總RNA制品為起始材料，利用核酸的堿基配對(duì)原理，通過oligo(dT)-纖維素或poly(U)-瓊脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地同時(shí)分離不同種類與大小的mRNA的分子群體。理論上，它們可編碼細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白質(zhì)與多肽分子。

（一）oligo(dT)-纖維素柱層析法

oligo(dT)-纖維素柱層析法是mRNA制備的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法。它是以oligo(dT)-纖維素填充層析柱，加入待分離的總RNA樣品，其中poly(A)⁺RNA在高鹽條件下，通過堿基互補(bǔ)，與oligo(dT)-纖維素形成穩(wěn)定的RNA-DNA雜交體，洗去未結(jié)合的其它RNA，然后在低鹽緩沖液中洗脫并回收poly(A)⁺RNA。從哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取大量的非放射性RNA 時(shí)，oligo(dT)-纖維素柱層析法是首選方法，回收的poly(A)⁺RNA量可達(dá)總RNA的1%～10%。但該法分離速度慢，易阻塞，不適合同時(shí)對(duì)多個(gè)標(biāo)本的處理，而且很難回收全部的poly(A)⁺RNA，故不適合對(duì)少量RNA樣品的分離。

（二）oligo(dT)-纖維素液相結(jié)合離心法

為適應(yīng)同時(shí)對(duì)多個(gè)標(biāo)本進(jìn)行處理的要求，應(yīng)選用批量的層析法。oligo(dT)-纖維素液相結(jié)合離心法不經(jīng)填柱，而是直接將oligo(dT)-纖維素加入到一系列的含不同RNA樣品的微量離心管中，通過離心收集吸附有poly(A)⁺RNA的oligo(dT)-纖維素，經(jīng)漂洗后，用含70%的乙醇洗脫液將吸附的poly(A)⁺RNA從oligo(dT)-纖維素上洗脫并沉淀出來。該法可同時(shí)批量處理多個(gè)樣品，而且能從少量的RNA樣品中分離出poly(A)⁺RNA。用本法分離poly(A)⁺RNA時(shí)，應(yīng)選用等級(jí)較高的oligo(dT)-纖維素，如oligo(dT)_18-30纖維素，而一般的柱層析填充的是oligo(dT)_12-18纖維素。

（三）其它方法

磁珠分離法則聯(lián)合利用了oligo(dT)與poly(A)的互補(bǔ)配對(duì)特性、生物素（biotin）與鏈親和素（streptavidin）的特異性結(jié)合以及磁性分離原理，對(duì)poly(A)⁺RNA進(jìn)行高效、靈敏、快速的分離（圖6-4）。其產(chǎn)量甚至比常規(guī)的oligo(dT)-纖維素柱層析法還高，且分離的poly(A)⁺RNA能用于幾乎所有的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。但它對(duì)組織或細(xì)胞的最大處理量每次不超過1克，而且磁珠很貴并需要專門的磁性分離架。