包涵體復性常見問題匯總
1.如何盡量避免蛋白表達過程中包涵體的形成？
(1). 包涵體的形成很大一部分原因是蛋白表達過快引起的，那么降低誘導溫度，例如25–30°C，或降低IPTG濃度(0.01–0.1mM)并延長誘導時間，或者換用作用較弱的啟動子，以此來減緩表達的速度
(2). 用自誘導培養(yǎng)基來替換IPTG誘導
(3). 攜帶大標簽如GST、 TrX共表達來增加可溶性
(4). 分子伴侶
2.包涵體純化包括哪些步驟？
(1) 菌體的破碎：首先通過細菌裂解離心得到粗制包涵體；
(2) 包涵體的洗滌：然后使用含有低濃度變性劑（如2M尿素）或不含變性劑的緩沖液清洗包涵體，去除一部分雜蛋白，通過離心得到精制包涵體；
(3) 溶解：再使用含有高濃度變性劑（如8M尿素或6M鹽酸胍）的緩沖液對精制包涵體進行溶解；
(4) 復性以及純化：復性操作方式主要分為稀釋、透析和柱上復性，可以先純化再復性，也可以先復性再純化；而柱上復性是在蛋白復性的過程中即對蛋白進行純化；
(5) 檢測分析：最后，對得到的樣品進行檢測分析，看是否得到天然態(tài)的蛋白。
3.包涵體蛋白復性效率低的原因是什么？
(1). 復性環(huán)境與復性過程不匹配
(2). 缺少必要的分子伴侶和折疊酶
(3). 中間體裸露的殘基容易彼此結(jié)合
4.6M的鹽酸胍溶解包涵體，然后用SDS-PAGE檢測，跑膠很慢是什么情況？
鹽酸胍樣品的離子強度很高，而離子濃度對局部的電流肯定影響比較大，用8M Urea 10倍稀釋鹽酸胍包含體增溶液，再試試
5.復性好的蛋白透析更換緩沖液時，蛋白都析出怎么辦？
(1). 可能會是梯度透析間隔時間太短，試著加長一下每次更換溶液的間隔時間。
(2). 要是目標蛋白中含有二硫鍵的話，透析液中也必須添加一定比例的GSSG/GSH以協(xié)助二硫鍵的正確形成，這在蛋白質(zhì)重折疊過程中是至關(guān)重要的。
(3). NaCl的濃度可再加大一點，因為它也是協(xié)助復性過程中常用的復性添加劑。
(4). 實在不行的話，可能還要想辦法向透析液中加入其它能夠抑制聚集同時協(xié)助復性的其它添加劑，如L-Arg、有機溶劑、PEG等。
6.變性劑（離液劑），去垢劑，表面活性劑溶解包涵體的分子原理分別是什么？
強的變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl 6M），是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因為鹽酸胍是較尿素強的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導致多肽鏈的自由氨基甲?；貏e是在堿性pH值下長期保溫時。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等是去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。對于目標蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。
7.變性的融合蛋白可以制備多抗或者單抗嗎？
變性蛋白的本質(zhì)還是天然蛋白，用來免疫動物具有更強的抗原性。只是天然蛋白中被包在內(nèi)部的抗原決 定簇也會暴露出來，如果用該變性抗原制備的抗體來檢測變性抗原是可以的，如果用來檢測天然蛋白，可能會 有假陽性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部，是否能用還 要看將來該單抗的用途。
8.包涵體蛋白制備抗體需要復性嗎?
做抗原得到蛋白的話不需要復性。包涵體蛋白就可以了。因為抗體是針對蛋白表位的（各個肽段），而不是功能。
除了一種情況就是蛋白空間構(gòu)象導致某些表位的產(chǎn)生，但是這個情況特殊的很，通常情況不需要考慮的。
9.包涵體純化后收率很低，如何優(yōu)化？
蛋白復性后濃度低，可能是在復性的過程中發(fā)生了降解?？梢詫托院玫牡鞍诐饪s跑膠看看。影響蛋白折疊收率的因素有溫度、添加劑和氧化還原劑：
溫度：高溫時復性的速率比較高，但是易于發(fā)生聚集，一般建議復性的起始溫度可以嘗試15℃；添加劑：添加劑可以促進結(jié)構(gòu)形成，增強蛋白之間的相互作用，提高溶解性，抑制聚集體的形成，降低側(cè)鏈的相互作用，如去垢劑，精氨酸，低濃度的尿素和鹽酸胍，PEG等；氧化還原劑：對于需要形成二硫鍵的蛋白來說，還需要使用一些氧化還原劑，幫助復性，形成正確的二硫鍵，常用的還原劑如DTT，β-ME等。
包涵體復性是一個十分復雜的過程，受諸多因素的制約。實驗中各種試劑和蛋白質(zhì)的濃度、操作溫度和復性時間、緩沖液的成分和pH值等因素都對實驗結(jié)果有著至關(guān)重要的作用。精確掌握每一個因素，才能獲得良好的實驗結(jié)果。
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