包涵體復(fù)性基礎(chǔ)知識
什么是包涵體蛋白？
包涵體是在重組蛋白表達(dá)過程中，在細(xì)胞（菌體）內(nèi)通過誘導(dǎo)新合成的肽鏈錯(cuò)誤折疊，而發(fā)生聚集產(chǎn)生的不溶于水、無生物活性的聚集體。特別是在大腸桿菌表達(dá)真核細(xì)胞蛋白時(shí)最為常見。包涵體蛋白無生物活性，為此常常讓需要制備活性蛋白來開展下游實(shí)驗(yàn)的科研工作者們頭痛不已。
包涵體形成的原因
主要因?yàn)樵诘鞍妆磉_(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。
| 包涵體形成原因 | |
| 表達(dá)量過高 | 折疊時(shí)間不夠 |
| 二硫鍵非正確配對 | |
| 蛋白間存在非特異性結(jié)合 | |
| 蛋白溶解度太低 | |
| 氨基酸組成 | 含硫氨基酸（半胱氨酸，胱氨酸） |
| 脯氨酸（D型，亞氨酸，在蛋白結(jié)構(gòu)折疊時(shí)往往需要異構(gòu)酶輔助） | |
| 蛋白所處環(huán)境 | 發(fā)酵溫度高 |
| 胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn) | |
| 異源蛋白 | 缺乏真核生物中翻譯后修飾所需要的酶類 |
包涵體蛋白的洗滌
包涵體蛋白的洗滌主要是洗去包涵體上的雜質(zhì)，如外膜蛋白，質(zhì)粒DNA等，方法上網(wǎng)上大同小異，但是注意一點(diǎn)，做包涵體的洗滌需要先做一個(gè)洗滌液的尿素濃度梯度，這樣才能達(dá)到最佳的洗滌效果。如果洗滌效果好的話，合適的洗滌液洗滌3次后，目的蛋白的純度可以達(dá)到90%左右，洗滌的效果通過page就可以看出來了，如果將洗滌液的濃度做一個(gè)合適的梯度，分別洗滌包涵體之后在一個(gè)板子上跑page，效果非常明顯的。
包涵體蛋白的溶解
溶解這一步常常會出現(xiàn)溶解不完全等問題，首先要確定超聲的質(zhì)量很好，不然的話尿素沒辦法接觸到包涵體也就達(dá)不到溶解的目的了。
其次，最好別在室溫放置太長時(shí)間，如果有可能的話可以在包涵體洗滌液1，2都洗滌之后加入8M的尿素，然后再在每個(gè)EP管中加入15ul的DTT后4度冰箱過夜。 可以超聲后低速離心如（4000/5min）去除細(xì)胞沉渣，因?yàn)榈退匐x心不足以使包涵體沉淀，而細(xì)胞殘?jiān)碗s質(zhì)卻可以離的下來。
這樣，過夜后，看看EP管內(nèi)是否還有沉淀，如果沒有的話就說明包涵體完全溶解了。
包涵體的復(fù)性
復(fù)性遵循的三原則：低濃度、平緩梯度、低溫
復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，以下這些包涵體蛋白復(fù)性注意事項(xiàng)前人總結(jié)的很好：
1.最適pH值范圍為8.0-9.0之間；（這樣可以防止自由硫醇的質(zhì)子化作用影響正確配對的二硫鍵的形成）
2.最適溫度4℃；
3.低分子化合物 如L-Arg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑，都可阻止蛋白聚集；Tris對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用；EDTA可以防止蛋白降解；
4.首先要獲得較高純度的包涵體；洗滌需徹底，加入適量Triton-X100
5.包涵體溶解要徹底，一般應(yīng)使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施；
6.透析前后均要離心；
7.復(fù)性完畢在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析12-24h ；
8.復(fù)性率的測定時(shí)要據(jù)變性蛋白和非變性蛋白的光學(xué)性質(zhì)不同測定
9.復(fù)性時(shí)的蛋白濃度不宜太高，一般為0.1-0.5mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟(jì)，而且很多蛋白在低濃度時(shí)不穩(wěn)定，很容易變性。
復(fù)性方法比較
| 復(fù)性方法 | 條件 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) | 文獻(xiàn)報(bào)道 | 質(zhì)量回收率 | 活性回收率 |
| 稀釋 | 低蛋白濃度 | 簡單 | 易沉淀；速度不易控制；體積大 | 4倍體積稀釋 | 約50% | 80% |
| 透析 | 低蛋白濃度；多次透析 | 控制折疊，緩慢進(jìn)行 | 易沉淀；不適合大規(guī)模操作；周期長 | 50倍體積透析液 | / | 約70% |
| 凝膠過濾層析 | 低蛋白濃度 | 柱上不保留；部分純化 | 柱頂端易聚集 | Superdex 75 | 約70% | 84% |
| 離子交換層析 | 無鹽酸胍；低鹽濃度 | 利于二硫鍵形成；部分純化 | 多點(diǎn)吸附，限制折疊 | SP Sepharose High Performance | 97% | 88% |
| 親和層析 | 含特殊結(jié)構(gòu)，無強(qiáng)還原劑 | 特異性強(qiáng)；部分純化；固定化分子可重復(fù)使用 | 成本高；配基易失活 | 固定化GroEL、DsbA/DsbC | 100% | / |
| 親和層析 | 含特殊結(jié)構(gòu)，無強(qiáng)還原劑 | 特異性強(qiáng)；部分純化；固定化分子可重復(fù)使用 | 成本高；配基易失活 | 固定化GroEL、DsbA/DsbC | 100% | / |
| 疏水相互作用層析 | 高鹽濃度吸附 | 抑制聚集；部分純化 | 需優(yōu)化 | Poros PE | 85% | 86.3% |
復(fù)性過程中使用的添加劑
蛋白質(zhì)的折疊是一級反應(yīng)，而相互聚集是二級以上反應(yīng)，由此可見低蛋白濃度有利于獲得較高的復(fù)性效率。但是低蛋白濃度必然要求巨型反應(yīng)容器，使得復(fù)性過程耗資嚴(yán)重，步驟繁瑣，這顯然阻礙了其用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。目前來說，最實(shí)際的做法是在復(fù)性過程上加上添加劑，希望實(shí)現(xiàn)高濃度下的蛋白質(zhì)復(fù)性。
小分子添加劑：如最早用的變性劑是脲素和鹽酸胍，主要通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白分子間的各種化學(xué)鍵，低濃度增加蛋白結(jié)構(gòu)柔韌性，干擾聚集，增加復(fù)性的效率。還有一些還原劑如DTT，可以游離巰基提供還原性環(huán)境，EDTA鰲合金屬離子，防止氧化。再比如一些脂類的脂質(zhì)體，可以結(jié)合蛋白疏水區(qū)，表面電荷和膜流動性，促進(jìn)折疊等等等等。
表面活性劑：如前面提到的去污劑Triton-X100，能夠與包涵體蛋白結(jié)合成復(fù)合物，降低分子間疏水作用。
分子伴侶：這樣的添加劑有DsbA、PDI，能夠催化二硫鍵的形成與重排，還有大家熟悉的PPI，可以催化脯氨酸肽鍵的順反異構(gòu)反應(yīng)。
復(fù)性結(jié)果的檢測
根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對包涵體蛋白的復(fù)性效率進(jìn)行檢測。
雙向凝膠電泳：檢測結(jié)構(gòu)均一性和二硫鍵的定位，第一向基于等電點(diǎn)不同，第二向按分子量不同，拖曳圖像指示巰基化、二硫鍵的形成。
光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測。
色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同， 生物學(xué)活性及比活測定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。
黏度和濁度測定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。
免疫學(xué)分析：如ELISA、Western Blot等，對蛋白的特異性進(jìn)行鑒別，重組蛋白作為抗原，復(fù)性結(jié)構(gòu)的差異會導(dǎo)致其抗體的結(jié)合親和力的改變，能夠較為準(zhǔn)確的反映包涵體蛋白的折疊狀態(tài)。
包涵體純化磁珠請參考 http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/Proteinextract/
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