漫談人工抗原的偶聯(lián)方法
抗體是生命科學(xué)研究中不可或缺的工具之一，應(yīng)用范圍包括蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)和鑒定、蛋白質(zhì)加工、蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、免疫中和反應(yīng)、蛋白質(zhì)同源結(jié)構(gòu)域研究、蛋白質(zhì)純化以及疾病的免疫診斷和治療。盡管抗體的制備過(guò)程不存在技術(shù)難點(diǎn)，但是抗原的選擇以及所制備抗體的用途對(duì)能否獲得一個(gè)優(yōu)質(zhì)高效的抗體至關(guān)重要。以下將對(duì)抗原多肽的設(shè)計(jì)、偶聯(lián)策略等逐一介紹.
1、抗原設(shè)計(jì)
首先選擇合適的多肽序列，明確最終產(chǎn)物的用途對(duì)選擇序列非常重要。如果僅僅需要生產(chǎn)針對(duì)蛋白質(zhì)某個(gè)區(qū)域的特異抗體，比如研究蛋白質(zhì)N端的前提物，我們就需要設(shè)計(jì)N末端的多肽抗原。如果抗體的使用目的是識(shí)別修飾的氨基酸，如磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸或者酪氨酸，乙酰化賴氨酸等，就必須對(duì)多肽進(jìn)行相應(yīng)的修飾。如果抗體最終用來(lái)識(shí)別自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，對(duì)抗原的設(shè)計(jì)就要求更高。一般情況下抗血清能夠識(shí)別用來(lái)免疫的多肽序列，但是不一定識(shí)別蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的抗原決定簇一般由6－12個(gè)氨基酸構(gòu)成，呈連續(xù)性或者非連續(xù)性序列。連續(xù)性抗原決定簇由連續(xù)的氨基酸序列構(gòu)成，而非連續(xù)抗原決定簇包括一組非連續(xù)氨基酸，這些氨基酸由于蛋白質(zhì)的折疊而形成在空間上相互毗鄰。針對(duì)連續(xù)性抗原決定簇的抗體能夠識(shí)別沒(méi)有被埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的序列，而非連續(xù)性抗原的抗體能否識(shí)別抗原決定簇取決于用于抗體生產(chǎn)的多肽是否存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。
氨基酸序列的親水性、表露性、柔韌性決定了多肽的抗原性。許多水融性的自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)其親水序列暴露在外測(cè)，而疏水性氨基酸序列包埋在內(nèi)部。抗體結(jié)合蛋白質(zhì)表面的抗原決定簇，另外抗原決定簇柔韌性比較高。蛋白質(zhì)的C末端經(jīng)常暴露在外測(cè)并且有較高的柔韌性，因此經(jīng)常被用來(lái)作為抗體生產(chǎn)的抗原。但是如果C末端是跨膜蛋白質(zhì)的膜內(nèi)部分，該序列可能由于疏水性太強(qiáng)而不適合用來(lái)作為抗原。同C末端序列類似，蛋白質(zhì)的N末端序列也經(jīng)常暴露在蛋白質(zhì)的表面，同樣為首選抗原序列。
預(yù)測(cè)蛋白特性（例如親水性、疏水性）及二級(jí)結(jié)構(gòu)（例如α－螺旋，β－折疊，β－回旋）的一些算法有助于選擇表露性較高，有抗原性的內(nèi)部序列以用于抗體生成。常見(jiàn)預(yù)測(cè)性算法有如下三種，Hopp及Woods所描述的親水性曲線給蛋白序列中的每一個(gè)氨基分配一個(gè)平均親水性值，對(duì)于一系列的相鄰氨基，平均親水性的最高點(diǎn)通常就位于抗原決定簇或在其附近。Kyte 及 Doolittle 所提出的另一算法略有不同，它主要是衡量蛋白序列的親水性及疏水性趨勢(shì)，該算法對(duì)于預(yù)測(cè)某蛋白的外部及內(nèi)部區(qū)域非常有用。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)則可以通過(guò)CHOU/FASMAN 或 LIM 所提出的算法來(lái)預(yù)測(cè)。表露性或易接近區(qū)常常和螺旋區(qū)或延展的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)相鄰。并且，具有β－回旋或雙性螺旋特性的序列區(qū)也具有較好的抗原特性。目前有許多商用軟件包都使用了這些不同的算法，例如MacVectorTM，DNAStarTM及PC-GeneTM。要想預(yù)測(cè)準(zhǔn)確，不能只使用一種算法。結(jié)合各種不同的預(yù)測(cè)方法來(lái)預(yù)測(cè)抗原性區(qū)域，可使成功率大大提高。
抗原性區(qū)域確定以后，接下來(lái)要確定多肽的長(zhǎng)度。關(guān)于選定多肽長(zhǎng)度有兩種不同的觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為長(zhǎng)的多肽（20－40個(gè)氨基酸）比較好，因?yàn)殚L(zhǎng)的多肽無(wú)疑會(huì)增加抗原基的數(shù)量。另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為小的多肽更有效，使用小的多肽能保障所產(chǎn)生抗體的位點(diǎn)特異性。但有一點(diǎn)是明確的，不管長(zhǎng)度如何，所選多肽必須能夠較容易地通過(guò)生化合成得到，并且能溶解到水溶性緩沖劑進(jìn)行載體蛋白的耦聯(lián)。由于受副反應(yīng)的影響較大，高于二十個(gè)氨基酸的多肽通常很難進(jìn)行高純度合成，并且常常會(huì)含有缺失性序列。另一方面，太短的多肽（<10個(gè)氨基酸）則會(huì)產(chǎn)生識(shí)別特異性很強(qiáng)的抗體，以至于無(wú)法識(shí)別整體蛋白，或親和性很低。因此綜合考慮制備性抗原地多肽有效長(zhǎng)度一般是10－20個(gè)氨基。這種長(zhǎng)度的多肽序列會(huì)最大程度的減小生化合成困難，具有一定的水溶性，也會(huì)具有一定程度的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
2、抗原準(zhǔn)備－耦聯(lián)方法
化學(xué)合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生很弱的免疫反應(yīng)，因而與載體蛋白耦聯(lián)是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激T－幫助細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)B－細(xì)胞反應(yīng)。用于與多肽耦聯(lián)的載體蛋白有多種，其中最常用的是keyhole limpet hemacyanin (KLH), 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）, 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛甲狀腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最為常用的多肽耦聯(lián)載體。BSA也常用來(lái)作為多肽載體，但由于BSA經(jīng)常被用做檢測(cè)試驗(yàn)的阻斷劑而使得該方法生產(chǎn)的抗體在應(yīng)用上存在著一定的局限性。
設(shè)計(jì)合成性多肽常常被忽略的一個(gè)方面是如何將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。例如，N－端序列需要通過(guò)C－端氨基酸耦聯(lián)，而C－端序列則需要通過(guò)N－端氨基酸耦聯(lián)。內(nèi)部序列則可以耦聯(lián)到任何一端。內(nèi)部序列耦聯(lián)的另一考量則是將非共軛端酰基化或氨基化，因?yàn)樵鞍追肿有蛄兄胁粫?huì)含有帶電荷的末端。最常用的耦聯(lián)方法都是基于自由氨基(alph-氨基 或 Lys)、sufhydryl (Cys)或羧基集團(tuán)(Asp, Glu, 或 alpha-羧基)的存在。所有的耦聯(lián)方法都應(yīng)該是通過(guò)羧基或氨基端殘基將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。所選序列不能有多個(gè)殘基都能參與所選耦聯(lián)化學(xué)反應(yīng)。如果多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)存在，可以考慮將多肽序列縮短，或者選擇所有反應(yīng)位點(diǎn)都位于一端的多肽。對(duì)于內(nèi)部序列通常會(huì)使用離所預(yù)測(cè)抗原位點(diǎn)較遠(yuǎn)的一端進(jìn)行耦聯(lián)，這樣可以避免可能的屏蔽問(wèn)題。
除非研究人員另做說(shuō)明，我們通常使用EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)或carbodiimide 方法將多肽和載體進(jìn)行耦聯(lián)。Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸的側(cè)鏈羧基集團(tuán)及末端羧基集團(tuán)，使之與主胺基發(fā)生耦聯(lián)反應(yīng)。激活的多肽與載體蛋白混合而產(chǎn)生最終的共軛體。如果載體蛋白先被激活，EDC方法則通過(guò)N－末端alpha－氨基，或者，如果序列中有賴氨酸的話，則可以通過(guò)賴氨酸的側(cè)鏈氨基與載體蛋白耦聯(lián)。m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide 酯(MBS)是一種雙性多肽耦聯(lián)試劑，可以將多肽與載體蛋白通過(guò)半胱氨酸耦聯(lián)。耦聯(lián)發(fā)生在半胱氨酸的硫醇基。如果多肽序列中不包括半胱氨酸，可以將一個(gè)半胱氨酸加到多肽的N-端或C-端，以獲得可控性更強(qiáng)的多肽與載體蛋白的耦聯(lián)。為了合成方便，我們建議將半胱氨酸加到多肽的N-末端。戊二醛是一種雙作用耦聯(lián)試劑，可以將兩個(gè)化合物通過(guò)氨基集團(tuán)耦聯(lián)在一起。戊二醛能起到非常靈活的間隔多肽和載體蛋白的作用，時(shí)多肽能盡可能的暴露給免疫系統(tǒng)。但是，戊二醛是一種反應(yīng)性很強(qiáng)的化合物，可以和Cys, Tyr及His等氨基酸發(fā)生一定程度的反應(yīng)。反應(yīng)后會(huì)形成結(jié)構(gòu)很難預(yù)測(cè)的共軛體。因此，如果多肽序列末端只含有一個(gè)單一的自由氨基時(shí)，戊二醛方法非常有用。如果多肽含有多個(gè)自由氨基集團(tuán)，會(huì)形成多聚合物，結(jié)構(gòu)很難預(yù)測(cè)，盡管有很高的抗原性。
因?yàn)榕cBSA耦聯(lián)的多肽刺激產(chǎn)生的抗血清也含有針對(duì)BSA的抗體，一次可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。盡管KLH較大并有抗原行，但它在耦聯(lián)過(guò)程中可能會(huì)沉淀，因而有時(shí)候會(huì)很難處理。卵清蛋白（OVA）是另一種可以使用的載體蛋白。當(dāng)要檢驗(yàn)抗體只是針對(duì)多肽而不是針對(duì)載體蛋白時(shí)，OVA時(shí)用作第二載體的很好選擇。當(dāng)要將抗體抗載體蛋白的反應(yīng)降到最低時(shí)，可以使用兔血清白蛋白做載體。用RSA耦聯(lián)體免疫過(guò)的兔子不太可能產(chǎn)生針對(duì)載體的抗體，因?yàn)镽SA是兔子自身的蛋白。如果注射動(dòng)物不是兔子RSA則不會(huì)被認(rèn)為是自體蛋白。
免疫系統(tǒng)是對(duì)多肽－載體蛋白整體發(fā)生反應(yīng)的，即免疫反應(yīng)有一部分是針對(duì)耦聯(lián)多肽，一部分是針對(duì)中間連接體，有一部分是針對(duì)載體蛋白。當(dāng)用ELISA做篩選時(shí)建議使用不同載體蛋白耦聯(lián)的多肽聚合物。如果ELISA是在非耦聯(lián)多肽涂層的多孔板上做時(shí)則沒(méi)有必要這樣做。
3、多抗原位點(diǎn)多肽
MAP 體系代表著生成抗多肽抗體的另一種獨(dú)特方式。該體系基于一個(gè)小的無(wú)抗原性的多分枝賴氨酸核，在該賴氨酸核上同時(shí)并行合成了多個(gè)多肽。其結(jié)果是形成了一個(gè)三維大分子，因?yàn)樗泻芨叩亩嚯目乖壤?，因而不再需要使用載體蛋白來(lái)誘導(dǎo)抗體反應(yīng)。每一個(gè)核分子可鏈接四個(gè)相同多肽。
理論上講，與耦聯(lián)到載體蛋白的單分子多肽相比，ＭＡＰ具有一定的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)椋停粒械馁嚢彼岷伺c多肽抗原相比顯得很小。這樣抗原的濃度就會(huì)達(dá)到最高。因而MAP體系具有很高的抗原性，與耦聯(lián)到載體蛋白的單分子多肽相比，具有很高的有效抗原濃度。有一點(diǎn)要指出的是，ＭＡＰ體系在合成是可能會(huì)有問(wèn)題。賴氨酸核的多分枝性允許多拷貝多肽的合成，但如果合成的多肽較長(zhǎng)，位阻(現(xiàn)象)會(huì)成為問(wèn)題，導(dǎo)致該多聚體的有些肽鏈臂丟失氨基，成為缺失性產(chǎn)品。復(fù)合體的高分子量使質(zhì)量控制措施（質(zhì)譜或 分析性HPLC）很難實(shí)行。MAP的間接合成則解決了分析問(wèn)題。間接合成時(shí)，多肽首先合成、純化，并作質(zhì)譜或 HPLC分析。合成的多肽抗原再通過(guò)Cys鏈接到賴氨酸核上。
4、動(dòng)物選擇
要生成好的抗體，必須選擇與抗原源差異較大的動(dòng)物。要想獲得最大的免疫反應(yīng)，絕對(duì)不能讓免疫動(dòng)物對(duì)抗原產(chǎn)生‘自體識(shí)別’。例如，要想生成抗人體蛋白的抗體，使用兔或老鼠比使用猴子要好。對(duì)于非常保守的哺乳動(dòng)物蛋白，使用鳥(niǎo)類動(dòng)物（如雞）效果較好。
5、動(dòng)物免疫
我們通常使用弗氏佐劑（Freund's）與抗原進(jìn)行混合。第一次注射完全使用Freund's的免疫輔助劑。輔助劑與抗原聯(lián)合使用，可以提高免疫反應(yīng)，從而用較少的疫苗可以產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。佐劑可以使抗原緩慢釋放，從而產(chǎn)生持續(xù)性刺激。注射方式為多位點(diǎn)的皮下注射。每只注射動(dòng)物都要先收集免疫前血樣，以用于和以后的免疫血樣比較。所采集的血清樣本含有不同的免疫型和亞型。
6、抗體保存
存儲(chǔ)抗體溶液的最常見(jiàn)問(wèn)題是細(xì)菌污染。加0.1％的疊氮化鈉保護(hù)劑則可以防止污染。如果您想長(zhǎng)期保存血清，建議使用疊氮化鈉?？贵w血清應(yīng)在－20度保存?？贵w溶液不宜反復(fù)凍融，這樣易導(dǎo)致抗體失活。建議將血漿存儲(chǔ)在－20度的季銨氯化物中。在該溫度下抗體可以穩(wěn)定保存多年。消過(guò)毒的血清或儲(chǔ)存溫度為－70度時(shí)則不需要添加防腐劑。當(dāng)保存時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，抗體溶液會(huì)產(chǎn)生一種不溶性的脂類成分。該脂類成分可以通過(guò)離心去除。如果脂類成分在水面上形成薄膜，只需將水溶液部分取出，并按上述方法保存即可。加入疊氮化鈉保護(hù)劑的抗體溶液如果形成脂類薄膜并不表明細(xì)菌污染。當(dāng)血清是用作細(xì)胞培養(yǎng)或體內(nèi)研究時(shí)，則不能加疊氮化鈉。
7、抗體鑒定
檢測(cè)抗多肽反應(yīng)是否發(fā)生的最簡(jiǎn)單方法就是抗多肽ELISA。有兩種技術(shù)可以將多肽鏈接到ELISA板上。第一種方法就是直接將多肽鏈接到盤(pán)上。但如果鏈接氨基酸恰好是抗原決定簇的一部分，則抗體無(wú)法和多肽進(jìn)一步鏈接，這樣產(chǎn)生假陰性結(jié)果的可能性增加。第二種方法則是先將多肽與載體蛋白耦合，然后將多肽－蛋白耦合體鏈接到ELISA盤(pán)上。這種鏈接方法會(huì)使抗體－多肽的結(jié)合成功率提高，因?yàn)槎嚯牟皇侵苯忧度氡P(pán)膜，因而會(huì)更加暴露給抗體。這種方法因而更可靠，可重復(fù)性更高。需要注意的是，用于該方法的載體蛋白必須不同于用于免疫耦合的載體蛋白。這樣會(huì)避免血清中抗載體蛋白反應(yīng)所導(dǎo)致的高背景反應(yīng)。
當(dāng)做血清檢測(cè)時(shí)，另一點(diǎn)需要記住的是，由于免疫多肽與自然多肽結(jié)構(gòu)上的差別，檢測(cè)時(shí)的抗多肽反應(yīng)與試劑的抗多肽反應(yīng)可能是不同的。任何檢測(cè)，尤其是測(cè)定滴定量以決定收獲點(diǎn)時(shí)，必須包括針對(duì)天然狀態(tài)下蛋白的檢測(cè)。當(dāng)然可以做針對(duì)天然狀態(tài)下蛋白的ELISA；但由于血清在不同檢測(cè)體系中表現(xiàn)會(huì)不一樣，因此最好在血清被日常使用的體系中進(jìn)行蛋白識(shí)別鑒定。如果血清將用于免疫沉淀反應(yīng)，就應(yīng)該進(jìn)行針對(duì)該反應(yīng)的檢測(cè)。
8、抗體純化
如抗血清使用過(guò)程中出現(xiàn)很高的背景，可使用幾種不同的方法對(duì)抗血清進(jìn)行純化。非常重要的是首先必須確定背景是非特異性的，也就是說(shuō)信號(hào)并非由抗血清對(duì)多肽的免疫反應(yīng)造成的。多肽競(jìng)爭(zhēng)是用來(lái)研究這一現(xiàn)象的很好的方法。
8.1 硫酸氨沉淀
硫酸氨沉淀是從溶液中分離蛋白質(zhì)的常用方法。這是一種比較原始，非特異性分離技術(shù)，可以用來(lái)分離大部分膜蛋白，免疫球蛋白會(huì)殘留于溶液中。在溶液中，蛋白質(zhì)會(huì)通過(guò)暴露于外的極性和離子基團(tuán)同水分子形成氫鍵。加入象氨或硫酸根這樣的小分子可以使蛋白質(zhì)失去結(jié)合的水分子，從而使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來(lái)。需要強(qiáng)調(diào)的是硫酸氨沉淀法難以得到高純度的抗體。其它大分子蛋白和混入絮狀沉淀中的蛋白會(huì)造成對(duì)抗體的污染。我們建議硫酸氨沉淀做為蛋白質(zhì)純化的一步，并采用其它方法對(duì)得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步純化。
8.2 蛋白A/G結(jié)合法
A 蛋白或G蛋白對(duì)IgG 抗體Fc臂具有特異吸附，此特性可用于純化IgG抗體。蛋白A產(chǎn)于葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。它可以吸附兩個(gè)IgG分子。此吸附基于對(duì)Fc臂的特異性，不影響抗原吸附位點(diǎn)。G蛋白產(chǎn)于G型鏈球菌（Group G streptococci）, G蛋白以同A蛋百類似的方式吸附IgG抗體的Fc臂。對(duì)不同物種產(chǎn)生的IgG，A蛋白和G蛋白的吸附能力有一定的差別。選用方法前應(yīng)對(duì)其吸附能力進(jìn)行檢測(cè)。比如，G蛋白適合羊IgG，但A蛋白不具有此特性。A蛋白和G蛋白都沒(méi)有對(duì)雞IgG的吸附能力。從A蛋白和G蛋白柱上洗脫抗體時(shí)，須非常小心，以免抗體變性。
8.3 免疫親和純化法
免疫親和純化法是用于從原血清中分離抗原特異性抗體的最長(zhǎng)用方法。同A蛋白和G蛋白不同，這種方法不能取得非特異性的Ig部分。在此方法中，多肽抗原首先共價(jià)結(jié)合于分離柱上的固定相。這樣，多抗樣品中對(duì)此多肽抗原有特異吸附的抗體將由于同抗原的吸附而留在分離柱上。未能結(jié)合的抗體將從分離柱上首先被洗脫，進(jìn)一步洗脫將得到特異性抗體。用免疫親和純化法得到的抗體具有很高的特異性。使用此方法時(shí)，會(huì)由于洗脫條件的選擇，有時(shí)造成所分離抗體的失活。所以，比較提純后樣品同原血清的抗體活性非常重要。
常見(jiàn)問(wèn)題
1．采集到的血清呈現(xiàn)紅色，是什么原因造成的？對(duì)使用有何影響？如何去除？
紅色是溶血造成的，也就是在血樣采集處理過(guò)程中紅細(xì)胞裂解，將血色素釋放到抗血清中。這在某些兔群中時(shí)有發(fā)生，尤其在較難放血的兔子中經(jīng)常碰到。沒(méi)有理由擔(dān)心溶血會(huì)影響血清質(zhì)量?？寡逯泻醒夭⒉粫?huì)影響抗血清的特性。并且任何紅細(xì)胞殘留物經(jīng)過(guò)血清處理中的標(biāo)準(zhǔn)離心步驟后都會(huì)被去掉。如果需要，血色素可以通過(guò)以下方法去除：往血清中加入45％(NH4)2SO4，在4攝氏度下攪拌兩個(gè)小時(shí)。然后將溶液離心，將表面漂浮物去除。沉淀物可以在等量的水中再溶解，然后在所選的測(cè)試體系中進(jìn)行同步檢測(cè)。如果抗多肽反應(yīng)已經(jīng)確定，則可以通過(guò)親和性純化將非特異性部分去除。
值得注意的是，將抗體從柱子上洗脫所需要的條件有可能會(huì)使抗體變性，從而導(dǎo)致對(duì)蛋白的親和性下降或消失。因此我們建議，在大規(guī)模純化血清前，可以先純化一個(gè)測(cè)試樣品。原始血清比純化的血清存儲(chǔ)時(shí)間要長(zhǎng)的多。可以在需要的時(shí)候純化一定的體積，這樣作對(duì)抗體的保存較為穩(wěn)妥。用于純化的親和柱一經(jīng)制備后，可以儲(chǔ)存以備后用。要進(jìn)行親和性純化需要將多肽連接到層析樹(shù)脂上。應(yīng)該選擇什么樣的活化親和性樹(shù)脂呢？我們一般推薦使用NH2鏈接將多肽耦聯(lián)到樹(shù)脂柱上。這種鏈接最穩(wěn)定，可以選擇NHS 或 CNBr活化樹(shù)脂(Pharmacia Biotech)進(jìn)行親和柱的抗體耦聯(lián)。
2．如何使用多肽親和性樹(shù)脂純化抗血清？
在4oC 將血清離心（2000xg），以去除任何顆粒或紅細(xì)胞；利用PBS或TBS（pH7.4）將血清按1:1稀釋，每毫升親和樹(shù)脂施用5 毫升 血清，流速不能超過(guò)1 毫升/分鐘，在280nm下測(cè)試吸光度。將未結(jié)合的部分按2-5倍的比例重新過(guò)柱。在4oC時(shí)耦聯(lián)效率最高；收集未結(jié)合材料，利用濃縮裝置（>10kd）進(jìn)行濃縮，以備測(cè)試；利用0.2M氨基乙酸（glycine）進(jìn)行洗脫（pH1－2），在pH2.0時(shí)開(kāi)始洗脫，在吸光度降到基線以下時(shí)收集洗脫液。將洗脫液的pH降低0.5-1，直到已沒(méi)有可檢測(cè)到的抗體從柱上洗下來(lái)；收集從純化柱上收集的各個(gè)部分，收集后通過(guò)加入1/10體積1 M Tris-HCl（pH=8.0） 或pH 8.0 的洗脫液將其中和；將純化的多肽進(jìn)行ELISA分析，以決定具有最高親和性的洗液部分。將適當(dāng)?shù)目贵w洗脫液濃縮至2-5mg/ml，混合50％甘油在－20oC下保存，或混合0.1% BSA在4oC下保存。加入0.01% NaN3作為防腐劑。
3．看起來(lái)有些渾濁的血清是否還可以使用？一般來(lái)講，這不會(huì)是問(wèn)題。使用前可以用0.2mm的過(guò)濾器去除血清中的小顆粒。
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