新型冠狀病毒的檢測方法及產(chǎn)品開發(fā)進展
作者：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 羅昭鋒
羅昭鋒，中科大生命科學(xué)實驗中心高級實驗師，也是中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)圖書館的高級顧問。
研究方向：
1.與中心儀器相關(guān)的技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用研究：如基于表面等離子共振(SPR)、等溫滴定微量熱(ITC)和毛細管電泳(CE)等技術(shù)相關(guān)的應(yīng)用研究;
2.與學(xué)院發(fā)展方向相關(guān)的公共技術(shù)平臺建設(shè)：如適配體篩選平臺建設(shè)。
【摘要】：新冠狀病毒(2019-nCoV)檢測目前只有熒光定量PCR方法和測序方法兩種被認可的方法。測序不具備快速篩查潛力，這里不做討論。目前國家藥監(jiān)局審批通過的都是熒光定量PCR的試劑盒。等溫擴增的檢測試劑盒，至少已有兩個單位開發(fā)成功，有望近幾天上市。等溫擴增的試劑盒上市后，檢測速度會大幅提升，檢測過程只需要15分鐘左右?；究梢詽M足當(dāng)下疫情控制要求。
【說明】：鑒于當(dāng)前技術(shù)進步非?？焖?，這里的信息隨時可能會發(fā)生變化，請謹慎參考。
對抗當(dāng)前的疫情，快速檢測方法的可以快速確診病人，快速隔離，快速采取措施。因此，各家科研機構(gòu)以及相關(guān)的企業(yè)，特別是體外診斷企業(yè)、測序公司、大學(xué)、研究所以及疾控系統(tǒng)等，在這次新冠狀病毒的檢測產(chǎn)品開發(fā)中，扮演了重要的角色。這里簡要介紹一下新冠狀病毒的檢測技術(shù)以及檢測產(chǎn)品的開發(fā)情況。最后，也會給出個人的一點建議，希望對產(chǎn)品開發(fā)，以及基金申請選題有所幫助。
一、新冠狀病毒相關(guān)檢測技術(shù)
世界衛(wèi)生組織及國家推薦的檢測方法是檢測病毒的基因，通過熒光定量RT-qPCR的方法或者是基因測序的方法(1)。其它的方法很難達到實際檢測所要求的靈敏度，這里基本不予考慮。測序方法由于比較慢，價格也比較昂貴，適合從事研究但不適合作為篩查手段。檢測核酸的方法中，由于這次的新冠狀病毒是RNA病毒，所以需要加入一步反轉(zhuǎn)錄的過程，再進行PCR擴增。目前的檢測方法有熒光定量PCR方法和等溫擴增的方法，還有數(shù)字PCR技術(shù)以及基于試紙檢測的方法。還有一些研究的目標(biāo)是加快樣品前處理，提升檢測通量，提升檢測自動化水平，以及降低對設(shè)備的要求，對檢測人員的要求和降低成本。目前試劑盒檢測的標(biāo)本主要是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清及血漿等。
1、 常規(guī)熒光定量PCR方法。目前上市的試劑盒都是基于核酸檢測的。最早上市的華大基因的方法，采用單基因檢測，前后大約需要3小時。后來，有些公司的產(chǎn)品有了一些改進，如多基因檢測，或者使用適合快速擴增的酶，都在一定程度上可以提升檢測速度。2020年1月28日，第二批獲得藥監(jiān)局批準(zhǔn)的試劑盒中，圣湘生物采用了獨創(chuàng)的RNA一步法技術(shù)，靈敏度為200copies/mL，樣本處理與擴增檢測在一個PCR反應(yīng)管中即可完成，最大程度減少生物安全風(fēng)險和交叉污染，可以在30分鐘給出結(jié)果，這應(yīng)該是這種方法的極限。而且應(yīng)該沒計算樣品處理的時間(2)。
2、 等溫擴增法：從原理上講，等溫擴增是較快且靈敏的方法。該方法也是檢測病毒的核酸，只是信號放大的策略不同，只需要一個溫度就可以了，不需要像常規(guī)PCR那樣，需要在2~3個不同的溫度之間進行循環(huán)。等溫擴增減少了升降溫，反應(yīng)時間要比常規(guī)的PCR快很多，只需要十幾分鐘。但是，基于這種技術(shù)的試劑盒開發(fā)要比常規(guī)Q-PCR試劑盒復(fù)雜一些，涉及多對引物，所以截至今天還沒有正式上市的產(chǎn)品。但至少有兩個團隊已經(jīng)完成產(chǎn)品開發(fā)。
3、 試紙條法(膠體金免疫層析法)：該方法快速方便，優(yōu)點適合快速篩選，便宜，不依賴儀器。在病毒濃度低的時候，會導(dǎo)致漏檢，獲得國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的可能性較小。
4、 樣品前處理及檢測自動化：除了在檢測環(huán)節(jié)提升檢測效率之外，縮短樣品前處理時間，提升檢測通量，提升檢測自動化也是一個重要研究方向。
5、 輔助技術(shù)開發(fā)：如開發(fā)能降低檢測對環(huán)境要求的儀器或試劑。這次所有的檢測都必須在P2(二級生物安全實驗室)進行。這是一大限制因素，這種實驗室建設(shè)周期長，審批慢。不可能短時間建成，只能利用現(xiàn)有資源。這也是湖北省每天檢測能力受限的重要原因。因此，開發(fā)不依賴于P2實驗室的檢測試劑和方法，也是當(dāng)前的一個重要方向。
二、相關(guān)產(chǎn)品介紹
1、 熒光定量PCR檢測試劑盒，目前共有6家公司的產(chǎn)品獲得國家藥監(jiān)局審批通過。
從1月10日公布新冠狀病毒的基因序列，到今天為止恰好經(jīng)歷了三周。這三周也是疫情快速發(fā)展變化的三周，也是各相關(guān)科研人員與時間賽跑的三周。已經(jīng)有6家獲得國家藥監(jiān)局的批準(zhǔn)上市。
1月26日，國家藥監(jiān)局僅用4天時間應(yīng)急審批通過上海之江生物、上海捷諾生物、華大基因、華大智造4家企業(yè)的4個新型冠狀病毒檢測試劑，創(chuàng)造了中國審評審批速度1月28日，批準(zhǔn)獲批的2個企業(yè)分別是達安基因和圣湘生物。至此，已有6家企業(yè)的產(chǎn)品正式獲批。還有多家企業(yè)等待審批，如輝睿生物、伯杰醫(yī)療等近20家企業(yè)。有些企業(yè)直接選擇在省內(nèi)審批，在省內(nèi)使用的方法。后面詳細附上相關(guān)公司及產(chǎn)品介紹。
2、 等溫擴增檢測試劑盒 尚未獲批
1月27日，徐濤院士團隊告訴記者，他們開發(fā)的等溫擴增試劑盒可以在30min內(nèi)給出結(jié)果。目前未見進一步報告(3)。
1月29日，中國疾病預(yù)防中心病毒病預(yù)防控制所聯(lián)合奇天基因成功研制新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸等溫擴增快速檢測試劑盒，可在8-15分鐘內(nèi)出結(jié)果(4)。
3、 試紙條法：
1月29日， SBC生物芯片上海國家工程研究中心旗下上海芯超生物科技有限公司宣布，其已成功研制出了新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體檢測試劑盒(膠體金免疫層析法)，加樣后15分鐘內(nèi)就可以觀察結(jié)果。該技術(shù)產(chǎn)品將可方便快速地用于社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心、基層醫(yī)院的早篩早診，不但增加檢測和診療的時效性，而且可以有效防止廣大群眾在大型醫(yī)院密集檢查而導(dǎo)致的交叉感染(5)。
同一天，紹興同創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司宣布研制出可以快速篩查冠狀病毒的篩查檢測試紙(膠體金法)，該試紙可十分鐘出結(jié)果(6)。
熱景生物也在不久前推出新型冠狀病毒IgM抗體檢測試劑(膠體金免疫層析法)，具有敏感性高、診斷時間早等優(yōu)點(26)。
4、 數(shù)字PCR法：紹興同創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司與李蘭娟院士的感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心開發(fā)出三款產(chǎn)品，其中之一就是基于數(shù)字PCR方法(7)。依據(jù)個人對數(shù)字PCR技術(shù)的了解，該技術(shù)對于臨床檢測的意義不大。通量低，價格高，速度慢，儀器少。
永諾醫(yī)療研發(fā)團隊針對新型冠狀病毒開發(fā)了數(shù)字PCR檢測試劑盒。該試劑盒采用創(chuàng)新的一步法逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR技術(shù)，將 2019-nCoV的RNA逆轉(zhuǎn)錄及數(shù)字PCR擴增整合到一個反應(yīng)體系，單管雙檢同時測定2019-nCoV兩個獨立基因，消除由于病毒變異帶來的漏檢風(fēng)險(21)。
銳訊推出的病毒檢測試劑盒也是市面上唯一一款兼容數(shù)字PCR儀和熒光PCR儀的試劑盒，大大降低了用戶應(yīng)用門檻。同時從技術(shù)原理上來說，數(shù)字PCR的檢測靈敏度較熒光定量PCR高1-2個數(shù)量級，更適合檢測微量痕量病毒，此次冠狀病毒感染也出現(xiàn)了早期癥狀不明顯，但是核酸檢測呈陽性的的“潛在感染者”和“隱藏患者”(22)。
1月28日的報道，新羿生物在國家CDC的指導(dǎo)下與清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系等單位協(xié)力合作，正在開發(fā)數(shù)字PCR法2019-nCoV核酸檢測試劑盒(23)。
三、其它尚未批準(zhǔn)的產(chǎn)品
1、 紹興同創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司與李蘭娟院士的感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心,迅速成功研制了三類冠狀病毒檢測系列產(chǎn)品，分別為： 新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法，免提取，45分鐘快速檢測)、新型冠狀病毒核酸低拷貝檢測試劑盒(數(shù)字PCR法，2小時常規(guī)檢測)、 用于初期篩查的檢測試紙(膠體金法，10分鐘快速檢測)(8)。
2、 山東艾克韋生物技術(shù)有限公司開發(fā)的試劑盒：1月26日下午，山東省藥監(jiān)局接到山東艾克韋生物技術(shù)有限公司研發(fā)的2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒，省器械檢驗中心立即組織檢驗，并于27日上午9點完成所有項目檢驗，產(chǎn)品符合技術(shù)要求，成為山東省法定檢驗機構(gòu)檢定合格的首個新型k狀病毒檢測產(chǎn)品(9)。
3、 中拓生物有限公司開發(fā)的系列產(chǎn)品 2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(多重?zé)晒釶CR法)、2019新型冠狀病毒(N基因)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)、2019新型冠狀病毒(ORF1ab基因)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)三種試劑盒均已成功通過國家食品藥品監(jiān)督管理局濟南醫(yī)療器械質(zhì)量管理監(jiān)督檢驗中心的注冊檢驗，產(chǎn)品將用于新型冠狀病毒的鑒別診斷，為疾病防控貢獻力量(10)。
4、 江蘇碩世生物股份有限公司開發(fā)的試劑盒。1月10日新型冠狀病毒正式公布后，江蘇碩世生物股份有限公司僅耗時3天，就完成了對新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的開發(fā)與生產(chǎn)，并快速向全國各省市提供診斷試劑與服務(wù)(11)。
5、 廣州多家機構(gòu)開發(fā)出了診斷試劑盒產(chǎn)品。包括達安基因、萬孚倍特、華銀醫(yī)藥、和信健康、微遠基因等企業(yè)研發(fā)出新型冠狀病毒檢測試劑盒后，廣納信捷醫(yī)療(以下簡稱“廣納信捷”)與中科院國家納米科學(xué)中心聯(lián)合攻關(guān)的新型冠狀病毒等溫快速檢測試劑盒研發(fā)接近完成，各項指標(biāo)均滿足臨床應(yīng)用要求，最快可實現(xiàn)30分鐘出檢測結(jié)果(12)。
6、 蘇州海苗生物科技有限公司研發(fā)的超敏2019-nCov檢測試劑盒于1月25日下線，該試劑盒可以快速檢測人傳人的二代、三代、四代新型冠狀病毒。它的成功研發(fā)，可為新型冠狀病毒感染肺炎的確診起到重要作(13)。
7、 世和基因生物技術(shù)有限公司研發(fā)的新型冠狀病毒檢測試劑盒于1月27日推出，并正在申請進入國家藥監(jiān)局為此次疫情開辟的應(yīng)急審批通道(14)。
8、 廈門大學(xué)專家團隊與致善公司聯(lián)合研制的新型冠狀病毒(2019-nCoV)現(xiàn)場檢測一體機已完成內(nèi)部測試，即將開展臨床評估。該型儀器可用于新型冠狀病毒的現(xiàn)場檢測，無需嚴格實驗室條件，無需專門培訓(xùn)，僅需一步加樣，儀器便可自動完成檢測并出具報告(15)。
9、 奧然生物全自動qPCR一體機，助力新型冠狀病毒的精準(zhǔn)快速檢測(16)。
10、 成都高新區(qū)企業(yè)邁克生物與1月29日成功研發(fā)出西南首個新型冠狀病毒檢測試劑盒，將為西部地區(qū)乃至全國有效篩查和防控新型冠狀病毒提供有力保障(17)。
11、 陜西佰美醫(yī)學(xué)檢驗實驗室開發(fā)的檢測試劑盒，已于1月27日，向西安市臨檢中心報備，服務(wù)社會(18)。
12、 廣東凱普生物科技股份有限公司于1月29日完成兩款新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒產(chǎn)品研制工作(19)。
13、 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院自主研發(fā)出新型冠狀病毒檢測試劑盒，并與泰普生物科學(xué)(中國)有限公司合作，迅速實現(xiàn)產(chǎn)學(xué)研轉(zhuǎn)化(20)。
14、據(jù)體外診斷網(wǎng)報道，新冠病毒檢測試劑可先用后申報，1月28日，已有81家企業(yè)已可提供(21)。
15.迅敏康1月21日迅敏康就已完成了“2019-nCoV新型冠狀病毒檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)”及配套IngeniFast??迅敏全自動PCR前處理系統(tǒng)的研發(fā)，并于(1月26日)正式推出(25)。
三、小結(jié)
1月30日晚，湖北省委書記蔣超良在新型冠狀病毒感染的肺炎疫情防控工作新聞發(fā)布會上表示，湖北省共有28家醫(yī)院能夠做樣本檢測，單日的樣本檢測能力已提高到約4000份?？梢姡瑱z測試劑和檢測能力短缺的情況有所緩解。
如果現(xiàn)在才開始開發(fā)RT-qPCR檢測試劑盒，需要仔細權(quán)衡一下。因為現(xiàn)在太多家企業(yè)在做相關(guān)產(chǎn)品，樂觀估計，等幾天之后開發(fā)完成，再等獲得認證通過，估計疫情差不多結(jié)束了。早期大量企業(yè)一起研究，一起競爭，提升效率，我認為是很有必要的。但在今天，近二十家產(chǎn)品已經(jīng)上市的情況下，潛在產(chǎn)能也許遠遠超出實際需求的情況下，再投入精力，研發(fā)重復(fù)性的檢測試劑盒，未免有些浪費。
但是，如果檢測方法有革命性的改進，依然值得探索。譬如能做到“省時、省錢、爽”，在檢測時間上能夠大大縮短，在檢測步驟上更為簡單，對環(huán)境對儀器對人員的要求更低;檢測成本更低;更加方便，更加安全，更加準(zhǔn)確等到你。這樣的話還是值得繼續(xù)去探索的。
我覺得當(dāng)前的研究方向，可以轉(zhuǎn)向治療，以及更基礎(chǔ)的研究方向。比如防控，治療，以及致病機理研究等方面。
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