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近期有媒體及專家反映新型冠狀病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性率低、有的病例重復(fù)檢測(cè)多次陰性后出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果、咽拭子標(biāo)本多次檢測(cè)陰性但最后在呼吸道灌洗液標(biāo)本中檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果、CT影像篩查出現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎特征但核酸檢測(cè)陰性等問(wèn)題。經(jīng)過(guò)與臨床分子診斷學(xué)專家、臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)專家、臨床呼吸病醫(yī)學(xué)專家、臨床影像醫(yī)學(xué)專家交流，現(xiàn)提出自己的一點(diǎn)看法。

一、關(guān)于核酸檢測(cè)在新型冠狀病毒肺炎患者診斷中的應(yīng)用

新型冠狀病毒肺炎（Novel Coronavirus Pneumonia, NCP）是由2019新型冠狀病毒（2019 Novel Coronavirus, 2019-nCoV）感染引起的一種急性傳染性疾病，而確定診斷的金標(biāo)準(zhǔn)就是能在患者體內(nèi)找到2019-nCoV的存在。核酸檢測(cè)就是檢測(cè)2019-nCoV基因中某些特定核酸序列的存在，因此從方法學(xué)層面考慮其作為實(shí)驗(yàn)室診斷金標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有任何疑問(wèn)，而CT（電子計(jì)算機(jī)斷層掃描）作為臨床影像學(xué)篩查指標(biāo)具有重要價(jià)值，但無(wú)論從早期診斷、鑒別診斷、排除診斷還是最終確診等方面都還具有一定的局限性，更無(wú)法替代病原學(xué)診斷。其實(shí)任何疾病本身都具有分層診斷的概念，在感染性疾病的診斷中，臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)史、影像學(xué)、病原學(xué)等指標(biāo)都發(fā)揮重要作用，但病原學(xué)診斷肯定是最精準(zhǔn)的診斷。當(dāng)然我們?cè)谥匾暫怂釞z測(cè)在病毒感染診斷中的重要價(jià)值的同時(shí)，也要客觀考慮由于其方法學(xué)特點(diǎn)、疾病發(fā)展過(guò)程、標(biāo)本采集、標(biāo)本保存與運(yùn)輸、核酸提取、擴(kuò)增體系、人員操作等因素都可能造成最后檢測(cè)結(jié)果的假陰性或假陽(yáng)性。

二、關(guān)于2019-nCoV核酸檢測(cè)方法

目前，無(wú)論是臨床實(shí)驗(yàn)室還是疾病控制中心（CDC）實(shí)驗(yàn)室，普遍應(yīng)用的是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，此檢測(cè)方法成熟可靠，并已在常規(guī)檢驗(yàn)和科研實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。該方法是將標(biāo)本中的特定核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，理論上每一次擴(kuò)增后的核酸數(shù)量都是成倍增加，經(jīng)過(guò)30次以上擴(kuò)增后，其核酸數(shù)量達(dá)到足夠通過(guò)熒光等常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)。如果有人說(shuō)目前實(shí)驗(yàn)室所用2019-nCoV核酸檢測(cè)方法不可靠，可能是因?yàn)槠鋵?duì)該方法原理和臨床應(yīng)用不了解。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法從采集標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過(guò)對(duì)標(biāo)本的接收、處理（有時(shí)從安全考慮需要滅活處理，這點(diǎn)對(duì)于生物安全至關(guān)重要，但也有專家提出可能影響檢測(cè)效率）、病毒核酸提取、核酸擴(kuò)增、數(shù)據(jù)處理及報(bào)告，一般需要約4個(gè)小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，如何改進(jìn)核酸提取和擴(kuò)增流程，縮短整個(gè)檢測(cè)時(shí)間是迫切需要解決的問(wèn)題。目前也有個(gè)別廠家的檢測(cè)試劑檢測(cè)的不是2019-nCoV核酸而是病毒進(jìn)入機(jī)體后機(jī)體產(chǎn)生的抗體，病毒進(jìn)入機(jī)體到機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體需要一段時(shí)間（窗口期），因此檢測(cè)到病毒抗體肯定滯后于檢測(cè)到病毒核酸。病毒抗體檢測(cè)一般用于篩查手段及流行病學(xué)調(diào)查，其敏感性、特異性、臨床應(yīng)用效率還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證和評(píng)估。

三、2019-nCoV核酸檢測(cè)陽(yáng)性率低等問(wèn)題

（一）患者的病程與病情
NCP患者的發(fā)病都會(huì)經(jīng)歷一個(gè)從感染后無(wú)癥狀，到輕度癥狀出現(xiàn)，再到嚴(yán)重癥狀出現(xiàn)的過(guò)程。不同病程、不同病情患者機(jī)體中的病毒存在量可能不同（已有病毒感染，但由于在相關(guān)部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以致于現(xiàn)有方法檢測(cè)不到，也稱窗口期）。因此，對(duì)臨床高度疑似NCP患者，應(yīng)該連續(xù)采集標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)（這可能是臨床患者多次檢測(cè)陰性，陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)晚的主要原因之一）。其實(shí)任何病原學(xué)檢測(cè)，都不能只根據(jù)一次陰性結(jié)果而做出排除性診斷，更不能根據(jù)核酸檢測(cè)陰性而漏診臨床高度疑似的NCP患者，尤其在高發(fā)地區(qū)，在大面積流行期間。

（二）標(biāo)本采集、運(yùn)輸及保存
1、標(biāo)本采集部位：很多專家從實(shí)踐工作中總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，鼻咽拭子標(biāo)本2019-nCoV核酸檢測(cè)陽(yáng)性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液標(biāo)本陽(yáng)性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的標(biāo)本（這也是這兩天被廣泛評(píng)論的某患者咽拭子標(biāo)本三次核酸檢測(cè)陰性，收住院后在搶救過(guò)程中采集肺泡灌洗液標(biāo)本核酸檢測(cè)陽(yáng)性的原因），但下呼吸道的痰、肺泡灌洗液標(biāo)本采集難度大、易引起患者噴射導(dǎo)致采集操作者感染風(fēng)險(xiǎn)大，一般情況不建議使用（氣管切開、上呼吸機(jī)搶救病人可用）。近期發(fā)布的第五版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》已將標(biāo)本采集“咽拭子”更新為“鼻咽拭子”。為了提高檢測(cè)陽(yáng)性率，建議采集同一病人多部位標(biāo)本，合并進(jìn)行檢測(cè)。比如，用口咽拭子、鼻咽拭子同時(shí)采集標(biāo)本，然后放到同一采集管中送檢。對(duì)于有消化道癥狀的疑似患者，同時(shí)采集糞便或肛拭子進(jìn)行檢測(cè)。

2、標(biāo)本采集方法：近期用于2019-nCoV核酸檢測(cè)標(biāo)本主要是口咽拭子，采集時(shí)讓患者張大嘴后用特制棉簽或小刷頭刮取其咽部采集帶病毒標(biāo)本。如果平時(shí)醫(yī)護(hù)人員咽拭子取樣不多，刮取標(biāo)本時(shí)患者的反應(yīng)又比較大，往往導(dǎo)致刮取標(biāo)本的位置不對(duì)，或力度和時(shí)間不夠，沒(méi)有刮取到帶病毒的標(biāo)本或刮取到的帶病毒標(biāo)本量少，最后導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果陰性。

3、標(biāo)本運(yùn)輸及保存條件：2019-nCoV為RNA病毒，很容易被外源性或細(xì)胞破壞后所釋放的RNA酶降解，而影響最后的檢測(cè)效率。嚴(yán)格來(lái)講標(biāo)本采集后應(yīng)及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室（疾控中心、醫(yī)院檢驗(yàn)科、第三方實(shí)驗(yàn)室），盡快完成檢測(cè)。標(biāo)本在常溫條件下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（幾個(gè)小時(shí)、十幾個(gè)小時(shí)、二十多個(gè)小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間），也可能是造成最后檢測(cè)結(jié)果假陰性的原因。近期有人提出使用防病毒核酸降解標(biāo)本采集管，但目前此類產(chǎn)品數(shù)量少、成本高、實(shí)際應(yīng)用效果也需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)。建議標(biāo)本采集后及時(shí)送檢，及時(shí)檢測(cè)（4小時(shí)）。如因某些原因標(biāo)本采集后不能及時(shí)送檢或及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)將其置于4℃保存（24小時(shí)）。24小時(shí)內(nèi)不能檢測(cè)的標(biāo)本，建議于-70℃以下保存并避免反復(fù)凍融。

（三）核酸檢測(cè)試劑
1、核酸提?。荷厦嬉褦⑹鲞^(guò)2019-nCoV核酸檢測(cè)需要對(duì)所采集標(biāo)本中核酸進(jìn)行提取。目前臨床實(shí)驗(yàn)室所用方法有手工提取和機(jī)器自動(dòng)或半自動(dòng)提取，通常情況下機(jī)器自動(dòng)提取方法的效率要優(yōu)于手工提取。而不同提取試劑和手工提取流程的掌控對(duì)最后提取到的核酸數(shù)量和質(zhì)量可能存在差別，而從標(biāo)本中所提取出的核酸數(shù)量和質(zhì)量對(duì)于檢測(cè)方法中下一個(gè)步驟核酸擴(kuò)增至關(guān)重要，從而也就直接影響最后的檢測(cè)結(jié)果。

2、核酸擴(kuò)增試劑：由于不同廠家試劑研發(fā)是根據(jù)2019-nCoV核酸Orf1ab、N、E、S等基因的特異性序列設(shè)計(jì)的擴(kuò)增探針（不同廠家的擴(kuò)增試劑可分為1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)靶標(biāo)基因位點(diǎn)檢測(cè)試劑），試劑中酶、金屬離子等成分與質(zhì)量的差異，都可能影響擴(kuò)增效率和最后檢測(cè)結(jié)果的靈敏度。

3、試劑應(yīng)用的特殊性：由于導(dǎo)致本次疫情的是2019-nCoV，加上其突發(fā)性，試劑生產(chǎn)商只能根據(jù)有限公開的病毒核酸研究數(shù)據(jù)開展試劑研發(fā)，國(guó)家相關(guān)部門最早推薦了一些廠家的檢測(cè)產(chǎn)品，后來(lái)又審批了一些廠家檢測(cè)試劑的注冊(cè)申請(qǐng)。目前開展2019-nCoV檢測(cè)試劑研發(fā)生產(chǎn)的廠家已超過(guò)百家，正常情況下一個(gè)臨床檢測(cè)試劑產(chǎn)品從研發(fā)到應(yīng)用需要通過(guò)一系列的臨床驗(yàn)證與評(píng)估，但由于本次疫情的特殊性，時(shí)間的緊迫性，所研發(fā)試劑來(lái)不及完成正常流程，特別是無(wú)法得到一定數(shù)量臨床患者標(biāo)本的驗(yàn)證。對(duì)于臨床某些高度疑似病例，或檢測(cè)結(jié)果難以確定病例，建議用2種以上試劑進(jìn)行檢測(cè)、驗(yàn)證。

（四）核酸擴(kuò)增儀器
目前不同實(shí)驗(yàn)室用于2019-nCoV核酸檢測(cè)的儀器（PCR儀或核酸擴(kuò)增儀）種類有所不同，價(jià)格上從幾萬(wàn)、十幾萬(wàn)、數(shù)十上百萬(wàn)不等，不同的設(shè)備對(duì)檢測(cè)過(guò)程中不同溫度的控制精度、對(duì)熒光信號(hào)檢測(cè)敏感度等不同，從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的差異。

以上是對(duì)近期媒體及專家反映2019-nCoV核酸檢測(cè)陽(yáng)性率低等問(wèn)題其可能原因的一些分析，由此可以理解，目前2019-nCoV核酸檢測(cè)中各種原因引起的這樣或那樣的問(wèn)題是現(xiàn)實(shí)存在的，也是難以避免的。我們不能因?yàn)檫@些問(wèn)題的存在而普遍懷疑、甚至否定目前實(shí)驗(yàn)室2019-nCoV核酸檢測(cè)結(jié)果。目前2019-nCoV核酸檢測(cè)大多在三級(jí)醫(yī)院或CDC二級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室開展，這些實(shí)驗(yàn)室的管理水平、技術(shù)人員素質(zhì)、檢驗(yàn)設(shè)備的先進(jìn)程度、檢驗(yàn)過(guò)程的質(zhì)量控制措施等方面可以說(shuō)大都是處于國(guó)際先進(jìn)水平，而各實(shí)驗(yàn)室也在通過(guò)工作開展中的回顧總結(jié)或通過(guò)實(shí)驗(yàn)室之間的經(jīng)驗(yàn)交流，不斷改進(jìn)、完善2019-nCoV核酸檢測(cè)方法。

近期中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)也組織了相關(guān)方面專家對(duì)2019-nCoV核酸檢測(cè)進(jìn)行了探討，并出臺(tái)了2019-nCoV核酸檢測(cè)相關(guān)專家共識(shí)，同時(shí)一些新的基因檢測(cè)平臺(tái)也在不斷研發(fā)。隨著基因測(cè)序、數(shù)字PCR、RT-PCR毛細(xì)管電泳等技術(shù)的應(yīng)用（國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的“新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案--試行第五版 修正版”中已將病毒基因測(cè)序與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸檢測(cè)列為實(shí)驗(yàn)室確診方法），2019-nCoV核酸檢測(cè)中的問(wèn)題肯定會(huì)得到持續(xù)改進(jìn)。