洞見：納米顆粒-蛋白冠對高豐度蛋白的耐受性增強(qiáng)血清蛋白質(zhì)組學(xué)的深度
Extreme Tolerance of Nanoparticle-Protein Corona to Ultra-High Abundance Proteins Enhances the Depth of Serum Proteomics
Qiqi Liu, Mengjie Wang, Xin Dai, Shuangqin Li, Haoxiang Guo, Haozhe Huang, Yueli Xie, Chenlu Xu, Yuan Liu, Weihong Tan
First published: 22 January 2025 https://doi.org/10.1002/advs.202413713
首次發(fā)表： 2025 年 1 月 22 日
https://doi.org/10.1002/advs.202413713
摘要：血清納米顆粒蛋白冠 （NPC，http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/8096211554.html） 提供特定的疾病信息，從而為高通量高深度蛋白質(zhì)組學(xué)開辟了一條新途徑，以促進(jìn)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。然而，人們對納米顆粒（NPs）和蛋白質(zhì)之間的相互作用及其在增強(qiáng)血清蛋白質(zhì)組學(xué)深度中的作用知之甚少。在此，進(jìn)行了一系列蛋白質(zhì)加標(biāo)實驗，以系統(tǒng)研究 NPC 形成過程中的蛋白質(zhì)消耗和富集。蛋白質(zhì)組學(xué)深度與血清濃度有關(guān)，NPC 對超高豐度蛋白表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受性。此外，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 （PPI），尤其是涉及白蛋白的相互作用，在促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)深度方面起著關(guān)鍵作用。此外，建立了三重蛋白測定法來考察蛋白質(zhì)結(jié)合親和力與濃度之間的關(guān)系。NPC 的形成是平衡親和力、濃度和 PPI 的產(chǎn)物。總體而言，本研究闡明了 NPs 如何實現(xiàn)蛋白質(zhì)耗竭和富集以增強(qiáng)血清蛋白質(zhì)組學(xué)深度，以更好地了解 NPC 作為蛋白質(zhì)組分析的重要工具。
1 引言
納米顆粒-蛋白冠 （NPC） 被定義為由蛋白質(zhì)層組成的結(jié)構(gòu)，這些蛋白質(zhì)層在引入生物環(huán)境（例如血液、血漿、血清、支氣管肺泡灌洗液和尿液）時吸附在納米顆粒 （NP） 上。蛋白冠的形成主要由 NP 的物理化學(xué)性質(zhì)（例如，納米級尺寸、高表面曲線和表面能）驅(qū)動。通常，納米材料的新生物身份將通過 NPC 的形成而被賦予，從而塑造它們的生物命運，包括生物分布、細(xì)胞攝取和治療效果。同時，通過高通量質(zhì)譜分析生物身份為生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和疾病診斷開辟了一條新途徑。廣泛、深入、快速和無偏倚的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)用于研究復(fù)雜的生物樣品，尤其是血清和血漿。
納米生物相互作用由靜電力、范德華相互作用、π-π 堆疊相互作用和氫鍵決定。通過 Vroman 效應(yīng)觀察和描述納米生物界面上蛋白質(zhì)之間的競爭和替換，該效應(yīng)表征了 NPC 形成的動態(tài)過程，并提高了我們對 NPC 形成機(jī)制的理解。眾所周知，NPC 的形成是快速且高度動態(tài)的，它是 NP 獨特理化性質(zhì)的產(chǎn)物，例如大小、形狀、孔隙率、表面改性和電荷以及手性，這會顯著影響蛋白質(zhì)組譜。然而，人們對 NPs 和蛋白質(zhì)之間的相互作用及其在增強(qiáng)血清蛋白質(zhì)組學(xué)深度中的作用知之甚少。
納米蛋白質(zhì)組學(xué)利用 NPC 形成和高分辨率質(zhì)譜法進(jìn)行快速、深入和無偏倚的蛋白質(zhì)組學(xué)。血清蛋白濃度范圍廣，跨越 ≈10 個數(shù)量級，這使得血清的全面分析極具挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)上，可以通過蛋白質(zhì)分級分離和去除高豐度蛋白來實現(xiàn)高深度蛋白質(zhì)組學(xué)，但兩者都是冗繁且昂貴的，因此蛋白質(zhì)組學(xué)研究僅限于少量臨床樣本。由于納米級尺寸和內(nèi)在的蛋白質(zhì)-NP 相互作用，NP 可以吸附蛋白質(zhì)。然而，使用 NPC，尤其是來自血清或血漿的 NPC，代表了一種令人信服的工具，可以消耗高豐度蛋白質(zhì)，但富集低豐度蛋白質(zhì)，用于深度蛋白質(zhì)組學(xué)。鼻咽癌正在被研究，為了生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和癌癥診斷的新方法。使用 NPC，我們開發(fā)了一個具有高深度蛋白質(zhì)組學(xué)的 ProteoFish 平臺，用于精確分類肺的良性和惡性小結(jié)節(jié)。Farokhzad 團(tuán)隊建立了一個 ProteoGraph 平臺，其中包含用于肺癌生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和診斷的五個不同的 NP。迄今為止，基于蛋白冠狀病毒的納米蛋白質(zhì)組學(xué)在肺癌、卵巢癌、阿爾茨海默病、胰腺癌、乳腺癌和經(jīng)典狀甲狀腺癌等各種疾病的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、診斷和預(yù)后方面取得了重大成功。一些主要文獻(xiàn)花費了大量精力來提高蛋白冠蛋白質(zhì)組學(xué)的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。然而，決定蛋白冠蛋白質(zhì)組譜的基本因素仍然不明確。因此，了解 NPC 促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)深度的基本驅(qū)動力，對于推進(jìn)這一強(qiáng)大的突破性工具的方法和合理應(yīng)用至關(guān)重要。
為了弄清楚 NPC 可以提高蛋白質(zhì)組學(xué)深度的根本原因，我們在此首先進(jìn)行了蛋白質(zhì)加標(biāo)測定，以系統(tǒng)研究 NPC 在蛋白質(zhì)耗竭和富集中的內(nèi)在特性以及在不同血清濃度下對超高豐度蛋白質(zhì)的耐受性（圖1）。PPI 是多種冠狀病毒蛋白的關(guān)鍵。然后，我們建立了一種三蛋白測定法，以了解結(jié)合親和力、濃度和 PPI 之間的平衡，從而使產(chǎn)品具有不同的蛋白質(zhì)組學(xué)特征。通過使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 （LC-MS/MS） 對蛋白冠譜進(jìn)行定性和定量分析，我們確定： 1） NPC 顯示出消耗高豐度蛋白質(zhì)和富集低豐度蛋白質(zhì)的固有特性，2） NPC 對血清中高豐度蛋白質(zhì)具有內(nèi)在耐受性，以及 3） 蛋白質(zhì)結(jié)合親和力、濃度和 PPI，以及這三者的平衡決定了 NPC 的概況。廈門普睿邁格生物科技有限公司提供高深度蛋白組學(xué)富集用蛋白冠磁珠（http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/8096211554.html）。
圖 1 通過加標(biāo)測定和三蛋白測定破譯增強(qiáng)的 NPC 蛋白質(zhì)組學(xué)深度的示意圖概述。
對三種感興趣的蛋白質(zhì)（HSA、LTF 和 C1QA）以及 5%、10%、25% 和 50% 血清濃度進(jìn)行加標(biāo)測定，以解釋 NPC 在蛋白質(zhì)耗竭和富集以及 NP 蛋白相互作用中的內(nèi)在特性（左）。建立三蛋白測定以確定 NPC 形成中蛋白質(zhì)結(jié)合親和力和濃度的平衡（右）。創(chuàng)建于 https://BioRender.com。
2 結(jié)果
2.1 血清濃度依賴性 NPC 的表征
首先，系統(tǒng)研究了血清濃度對 NPC 形成的影響，如圖 2A 所示。通過透射電子顯微鏡 （TEM） 和動態(tài)光散射 （DLS） 對 Fe3O4@SiO2 NPs 進(jìn)行表征。TEM 圖像和測得的流體動力學(xué)直徑顯示，Fe3O4@SiO2 NPs 的直徑為 ≈200 nm（圖 1B、C;圖 S1、S2，支持信息）。與血清孵育后，Fe3O4@SiO2 NPC 的流體動力學(xué)直徑從 208 增加到 298.3 nm（5%）、281.5 nm （10%）、283.0 nm （25%） 和 287.4 nm （50%），這可能歸因于布朗動力學(xué)，它描述了擴(kuò)散狀態(tài)下分子系統(tǒng) （NP） 的動力學(xué)（圖 2C;圖 S2，表 S1，支持信息）。Zeta 電位測量還表明，隨著血清濃度的增加，NPC 的電位升高（圖 2D）。
圖 2 血清濃度依賴性 Fe3O4@SiO2 NPC 形成和蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
A） 不同血清濃度的 NPC 形成和分析方案。B） 裸 Fe3O4@SiO2 NP 的 TEM 圖像。比例尺，200 nm。（C-D）去離子水中裸 Fe3O4@SiO2 NP 及其 NPC 的流體動力學(xué)直徑 （C） 和 zeta 電位 （D）。均值 ± S.D.，n = 3。E） 上圖：Fe3O4@SiO2 個 NPC （5%–50%） 的蛋白質(zhì)量。均值 ± S.D.，n = 3。值表示平均值。下圖：純血清和 NPC 的蛋白質(zhì)組學(xué)分析深度 （5%–50%）。F） 分別對血清和不同血清濃度的每個 NPC 中鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行組成相似性分析。G） 按分子量 （MW） 對蛋白冠蛋白進(jìn)行分類。H） 使用 STRING 數(shù)據(jù)庫的 NPC 中冠蛋白 （5%–50%） 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)。所需的最低交互分?jǐn)?shù) = 0.900。不顯示斷開連接的蛋白質(zhì)。I） （H） 中每個冠狀 PPI 網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點和邊數(shù)。
使用 SDS-PAGE 凝膠觀察 Fe3O4@SiO2 NPC 的洗脫蛋白（圖 S3A，支持信息），然后對凝膠條帶進(jìn)行半定量光密度分析（圖 S3B，支持信息）。NPC 中蛋白質(zhì)的數(shù)量和數(shù)量取決于血清濃度，這與凝膠條帶結(jié)果一致（圖 2E）。洗脫蛋白量為 0.185 mg （5%），遠(yuǎn)小于 5% 血清中蛋白總量 （0.763 mg），表明血清中總蛋白遠(yuǎn)多于吸附在 NPs 表面的蛋白。蛋白質(zhì)鑒定計數(shù)隨血清濃度的變化顯示出與基于相同回歸模型的先前研究相似的趨勢（圖 S4，支持信息）。值得注意的是，NPC 獨特蛋白的數(shù)量以血清濃度依賴性方式顯示出明顯的增加趨勢（圖 2F;圖 S5，支持信息）。在圖 2G 中，根據(jù)分子量 （MW） 的蛋白質(zhì)表征顯示，NPC 吸附的蛋白質(zhì)更多，MW 小于 50 kDa。
STRING 是已知和預(yù)測的 PPI 的生物數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)資源。在這里，我們使用 STRING 數(shù)據(jù)庫根據(jù) PPI 進(jìn)一步探索蛋白冠蛋白的生物網(wǎng)絡(luò)（圖 2H）。我們觀察到一個更廣泛和更濃縮的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，因為隨著血清濃度從 5% 增加到 50%，邊緣和淋巴結(jié)數(shù)量都增加了（圖 2I）。網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的這種擴(kuò)展也與獨特蛋白質(zhì)數(shù)量的增加有關(guān)，這表明 NPC 的形成在其核心是由復(fù)雜的生物 PPI 促進(jìn)的，反過來又有助于蛋白質(zhì)組覆蓋率的增加。
2.2 低豐度蛋白質(zhì)富集，但高豐度蛋白質(zhì)耗盡，以提高蛋白質(zhì)組學(xué)深度
為了進(jìn)一步探究支撐 NPC 蛋白質(zhì)組學(xué)深度的蛋白質(zhì)富集和耗竭，我們首先分析了蛋白質(zhì)豐度 （%） 在三個定義區(qū)間（低：< 0.1%;中：0.1%–1%;高：>1%）的分布（圖3A）。低豐度蛋白質(zhì)包含在血清和 NPC 中鑒定的大部分蛋白質(zhì)（圖 3B）。值得注意的是，低豐度蛋白在 NPC 中的代表性顯示出明顯的趨勢，即隨著血清濃度的增加而增加。具體來說，NPC 中低豐度蛋白的數(shù)量是純血清的 1.26 （5%） 、 1.63 （10%） 、 1.73 （25%） 和 1.92 （50%） 倍 （圖 3B），表明較高的蛋白質(zhì)組學(xué)覆蓋率主要歸因于低豐度蛋白。此外，NPC 中獨特低豐度蛋白的數(shù)量從 175 （5%） 顯著增加到 351 （50%）（圖 S6，支持信息）。
圖 3 Fe3O4@SiO2 NPC 的低豐度蛋白質(zhì)富集和高豐度蛋白質(zhì)耗竭，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)組學(xué)深度。
A） 通過 LC-MS/MS 測定血清中鑒定蛋白質(zhì)豐度和不同血清濃度的 NPC 的分布。豐度在 Log10 中以百分比表示，并分為三個水平。紅色、橙色和淺綠色群體分別代表蛋白質(zhì)豐度高 （> 1%）、中 （0.1%–1%） 和低 （< 0.1%）。B） 按豐度水平分類的血清和 NPC 中蛋白質(zhì)的數(shù)量統(tǒng)計。C，D） 富集和耗竭的總體豐度轉(zhuǎn)變。不同血清濃度的 NPC 中富集蛋白 （C） 和耗盡蛋白 （D） 的豐度（NPC 與血清）的倍數(shù)變化 （FC）。虛線表示富集蛋白的豐度增加 50 倍 （C） 或耗盡蛋白的豐度降低 90% （D）。符號顏色表示每種蛋白質(zhì)的分子量。黑色點表示大于 100 kDa 的 MW 蛋白質(zhì)。E） 血清和 NPC 中 LTF 和 C1QA 的血清濃度依賴性豐度轉(zhuǎn)變 F） 血清和 NPC 中 HSA 的豐度 G，H） 不同血清濃度下血清和 NPC 中豐度最高的 100 種蛋白質(zhì)和最低 （H） 的蛋白質(zhì)。上圖：蛋白質(zhì)豐度的小提琴圖。Lower：相應(yīng)的 100 種蛋白質(zhì)的總和。I） 不同血清濃度下 NPC 蛋白質(zhì)富集或耗竭能力的定量表征。
隨后，我們根據(jù) NPC 與血清的倍數(shù)變化 （FC） 值將蛋白質(zhì)分為富集組（圖 3C）和耗盡組（圖 3D），從而反映了與血清相比的相對蛋白質(zhì)豐度。富集蛋白的最高 FC 值顯示出明顯的增加趨勢，從 NPC 的 46.3 （5%） 開始，上升到 NPC 的 285.2 （50%） （圖 3C）。作為富集蛋白的例子，乳轉(zhuǎn)鐵蛋白 （LTF） 和補(bǔ)體 C1q 亞組分亞基 A （C1QA） 與血清濃度成比例持續(xù)增加（圖 3E）。NPC 組耗盡蛋白的最低 FC 值（圖 3D）范圍為 0.0001 至 0.001，導(dǎo)致血清蛋白豐度降低超過 99%。人血清白蛋白是最豐富的蛋白質(zhì)，在血清中占 52.0%，但在所有 NPC 中均顯示顯著消耗（圖 3F）。NPC 中相應(yīng)的最豐富的蛋白質(zhì)分別占 24.1% （5%）、17.6% （10%）、14.0% （25%） 和 12.4% （50%），而血清和 NPC 中豐度最高的 100 種蛋白質(zhì)的總和幾乎相等 （≈97.5%）（圖 3G）。在血清和 NPC 中至少有 100 種豐度蛋白質(zhì)的情況下，每個血清濃度依賴性 NPC 組的蛋白質(zhì)豐度總和遠(yuǎn)小于集體純血清組（圖 3H）。此外，我們使用均方誤差 （MSE） 量化了富集和耗盡的蛋白質(zhì)（圖 S7，支持信息）。所有 NPC 在耗盡的蛋白質(zhì)中均顯示出較高的值，表明蛋白質(zhì)耗竭在促進(jìn)增強(qiáng)血清蛋白質(zhì)組覆蓋率方面比蛋白質(zhì)富集起著更重要的作用（圖 3I）。
為了測試蛋白質(zhì)富集和耗竭是否可以擴(kuò)展到其他材料，我們比較了 SiO2、Fe3O4 和 CeO2 三種不同但尺寸相同 （200 nm） 的納米材料。如圖 S8（支持信息）所示，蛋白冠蛋白質(zhì)組成分隨不同的材料而變化。SiO2 的蛋白質(zhì)數(shù)量為 581 個，Fe3O4 的蛋白質(zhì)數(shù)量為 559個，CeO2 的蛋白質(zhì)數(shù)量為 941 個（圖 S8A，支持信息）。它們都表現(xiàn)出高豐度蛋白質(zhì)耗竭和低豐度蛋白質(zhì)富集現(xiàn)象。SiO2 的 HSA 百分比為 2.6%，Fe3O4 為 5.1%，CeO2 為 4.1%（圖 S8B，支持信息）。此外，在上述所有納米材料和 Fe3O4@SiO2 的 NPC 中觀察到血清蛋白的相似分布，其中耗盡蛋白質(zhì)的 MSE 高于富集蛋白質(zhì)的 MSE（圖 S9，支持信息）。因此，該材料對蛋白冠成分有顯著影響，蛋白質(zhì)消耗和富集以提高蛋白質(zhì)組學(xué)深度可以應(yīng)用于其他納米材料，例如 SiO2、Fe3O4和 CeO2。以 Fe3O4 為例，我們研究了 5% 至 50% 不同血清濃度下的蛋白冠成分。SDS-PAGE 凝膠圖像及其半定量光密度測定分析顯示，當(dāng)使用不同的血清濃度形成 Fe3O4 的 NPC 時，存在明顯差異（圖 S10，支持信息）。為了研究尺寸和曲率對 NPC 組件的影響，我們比較了 200 nm SiO2 和 500 nm SiO2 的 NPC 曲線。如下圖 S11A（支持信息）所示，200 nm SiO2 的 HSA 總豐度為 2.5%，而 500 nm SiO2 的 HSA 總豐度為 3.9%。此外，200 nm SiO2 和 500 nm SiO2 之間的蛋白質(zhì)總數(shù)、耗盡蛋白質(zhì)和富集蛋白質(zhì)不同（圖 S11B，支持信息）。此外，還分析了不同 NP 大小的 MW 分布。盡管 NP 大小對蛋白冠成分有顯著影響，但未觀察到 MW 分布的明顯差異（圖 S11C、D，支持信息）。
2.3 NPC 的形成類似于免疫反應(yīng)
雖然我們確定了蛋白質(zhì)耗竭與富集對 NPC 形成的深遠(yuǎn)影響，但造成這種影響的基本驅(qū)動力仍有待闡明。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，我們更仔細(xì)地研究了蛋白質(zhì)，這是生命的基本功能單位，甚至更仔細(xì)地研究了免疫反應(yīng)，這是宿主在受到外來生物入侵時最重要的功能之一。許多血清蛋白參與免疫反應(yīng)，例如補(bǔ)體蛋白和抗體，它們在先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用以殺死病原體。例如，補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)可以通過 C1q 與抗體-抗原復(fù)合物的結(jié)合而被激活。因此，在將 NPs 引入血清后，免疫相關(guān)血清蛋白對 NPC 的吸附可以比作免疫反應(yīng)的一種體外模擬也就不足為奇了。
值得注意的是，在由多種成分組成的體液先天免疫反應(yīng)中，包括例如中和抗體和補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)，蛋白質(zhì)豐度隨著血清濃度的增加而增加，而在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中，它也使用細(xì)胞和蛋白質(zhì)，如免疫球蛋白，來對抗感染以響應(yīng)所謂的抗原，蛋白質(zhì)豐度隨著血清濃度的增加而降低（圖4A).為了驗證這一前提，我們進(jìn)一步分析了先天免疫的三種補(bǔ)體激活途徑，包括由 C1q 與病原體表面結(jié)合觸發(fā)的經(jīng)典途徑，分別由抗原或 C3 水解觸發(fā)的替代途徑，以及通過與病原體表面所謂的病原體相關(guān)分子模式 （PAMP） 結(jié)合的凝集素。如圖 4B 所示，與經(jīng)典途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)豐度增加，而與替代途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)則顯示出沿血清濃度下降的趨勢。與凝集素途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)顯示略有增加。如上所述，隨著血清濃度的增加，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)內(nèi)的免疫球蛋白顯示出減少但仍相對穩(wěn)定的模式（圖 S12，支持信息）。此外，脂質(zhì)代謝作為 T 細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與許多免疫相關(guān)疾病有關(guān)。引人注目的是，在脂質(zhì)代謝的五種主要蛋白中，介導(dǎo)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和脂蛋白清除的 APOE 隨著血清濃度的增加而增加其 NPC 豐度，而 APOA1、APOB、APOC2 和 APOC3 均下降（圖 4C）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明各種免疫相關(guān)蛋白參與了 NPC 的形成。基于生物過程 （BP） 的蛋白冠蛋白分類表明，免疫相關(guān)蛋白占總蛋白的主要部分（圖 4D）。此外，NPC 的基因本體論 （GO） 富集分析顯示，NPC 最富集的 BP （5%） 是補(bǔ)體激活和體液免疫反應(yīng)（圖 4E）。SiO2、Fe3、O4 和 CeO2 NPs 形成 NPC 的蛋白質(zhì)組譜分析也表明豐富的免疫相關(guān)蛋白，包括適應(yīng)性免疫和先天免疫（圖 S13，支持信息）。與生物免疫反應(yīng)一致，這些結(jié)果告訴我們，將 NP 引入血清中形成 NPC 類似于免疫反應(yīng)。
圖 4 NPC 免疫相關(guān)蛋白的分析。
A） 血清和 NPC 中適應(yīng)性和先天免疫的組成分析 （5%-50%）。B） 血清和 NPC 中先天免疫（補(bǔ)體激活途徑）的組成分析 （5%–50%）。C） 血清和 NPC 中脂質(zhì)代謝的成分分析 （5%–50%）。D） 基于生物過程的冠狀病毒分類，包括免疫、脂質(zhì)代謝、炎癥、血管生成和血液凝固。E） NPC 的功能豐富 （5%）。顯示了生物過程的 6 個最重要的 GO 項。
2.4 NPC 對超高豐度蛋白的內(nèi)在耐受性
我們之前證明，NPC 通過消耗高豐度蛋白質(zhì)和富集獨特的低豐度蛋白質(zhì)來增強(qiáng)血清蛋白質(zhì)組覆蓋率。在這里，我們研究了高豐度蛋白對 NPC 形成的影響。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，根據(jù) HSA、LTF 和 C1QA 三種目標(biāo)蛋白在純血清中的基線濃度，對它們進(jìn)行了三重蛋白系列的加標(biāo)測定。如前所述，C1QA 和 LTF 均被鑒定為低豐度蛋白，在 NPC 形成過程中具有潛在的結(jié)合優(yōu)勢（圖 2E），而 HSA 是一種公認(rèn)的高豐度血清蛋白。此外，LTF 和 C1QA 都是屬于先天免疫系統(tǒng)的多功能蛋白。血清 LTF 也是過敏性鼻炎、遺傳性血小板減少癥 2 和嚴(yán)重再生障礙性貧血的潛在生物標(biāo)志物。如上所述，C1QA 作為主要激活劑通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。血漿中 C1QA 的豐度會顯著改變疾病狀態(tài)，并參與癌癥中的腫瘤微環(huán)境 （TME） 構(gòu)建、免疫調(diào)節(jié)和炎癥。
在我們的加標(biāo)測定中，HSA 作為血清中最豐富的蛋白質(zhì)，加標(biāo)水平高達(dá) 20 倍。相比之下，最初以低得多的濃度（分別為 0.0028% 和 0.0102%）存在的 LTF 和 C1QA 以高達(dá) 100 倍的水平加標(biāo)，以評估它們在不同濃度下的相對數(shù)量。來自這些加標(biāo)測定的 NPC 的 SDS-PAGE 分析顯示，隨著所有血清濃度中加標(biāo)倍數(shù)的增加，HSA 變得更加明顯（圖 S14A，支持信息）。然而，LTF 和 C1QA 的條帶可見度增強(qiáng)主要在 50% 血清濃度衍生的 NPC 中觀察到（圖 S14B、C，支持信息）。因此，通過 LC-MS/MS 進(jìn)一步表征了 5% 和 50% 的所有加標(biāo)分析。
有趣的是，盡管將不同濃度的 HSA 加標(biāo)到 5 倍甚至 20 倍的血清中，但 LC-MS/MS 未觀察到蛋白質(zhì)組鑒定覆蓋率的顯著變化，表明 NPC 對超高豐度蛋白具有內(nèi)在耐受性（圖5A）。LTF 和 C1QA 的加標(biāo)從 5 倍到 100 倍（分別為血清的 5% 和 50%）也沒有改變蛋白質(zhì)鑒定覆蓋率，進(jìn)一步證明了 NPC 在血清蛋白覆蓋率方面的耐受性和穩(wěn)定性（圖 5B、C）。正如預(yù)期的那樣，HSA、LTF 和 C1QA 在總蛋白中的豐度和等級隨著添加更多的加標(biāo)而增加（圖 5D-F;圖 S15，支持信息）。值得注意的是，即使 LTF 和 C1QA 出現(xiàn)加標(biāo)，高濃度血清（50% 對 5%）導(dǎo)致更好的蛋白質(zhì)組學(xué)深度和更獨特蛋白質(zhì)的 NPC 富集的現(xiàn)象與本研究中先前的發(fā)現(xiàn)一致（圖 5A-C;圖 S16，支持信息）。為了測試對高豐度蛋白質(zhì)的耐受性是否可以擴(kuò)展到其他納米材料，我們還對 CeO2 NP 進(jìn)行了 HSA 加標(biāo)（圖 S17，支持信息）。隨著血清中加入更多的 HSA，蛋白冠中 HSA 的豐度從 10.4%（5 倍）增加到 20.0%（20 倍）（圖 S17B，支持信息）。然而，NPC 的蛋白質(zhì)類型數(shù)量沒有明顯變化（圖 S17C，支持信息），證實了 CeO2 NPC 對高豐度蛋白質(zhì)的內(nèi)在耐受性。
圖 5 加標(biāo)測定。
A-C） 在 HSA （A）、LTF （B） 和 C1QA （C） 加標(biāo)測定的 Fe3O4@SiO2 個 NPC （5% 和 50%） 中鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量。P 值由 Wilcoxon 嘆息秩檢驗生成。n.s. 表示無意義 （P > 0.05）。D–F） 每次蛋白加標(biāo)前后 NPC 中 HSA （D） 、LTF （E） 和 C1QA （F） 的順序變化 （分別為 5% 和 50%）。豐度的 Log2 FC （加標(biāo)后與加標(biāo)前） 在顏色條中表示。HSA 的加標(biāo)高達(dá) 20 倍。LTF 和 C1QA 被加標(biāo)至最高 100 倍的倍數(shù)。G-I） HSA （G）、LTF （H） 和 C1QA （I） 加標(biāo)前后 NPC （5% 和 50%） 的血清濃度依賴性調(diào)節(jié)模式。J-L） 在相應(yīng)蛋白質(zhì)加標(biāo)前后加標(biāo) NPC （50%） 中與 HSA （J） 、LTF （K） 和 C1QA （L） 相關(guān)的蛋白質(zhì)的順序變化。關(guān)聯(lián)的物理 PPI 子網(wǎng)顯示在相應(yīng)的折線圖下方，并使用 STRING 數(shù)據(jù)庫生成。所需的最低交互分?jǐn)?shù) = 0.700。
然而，這些結(jié)果并沒有直接解決 NPC 作為消耗高豐度蛋白質(zhì)的強(qiáng)大工具的行為，而是富集低豐度蛋白質(zhì)，用于深度蛋白質(zhì)組學(xué)。因此，為了研究加標(biāo)蛋白對蛋白質(zhì)消耗和富集的影響，我們進(jìn)一步分析了不同加標(biāo)條件下富集和耗盡的蛋白質(zhì)。如圖 5G 所示，富集的蛋白質(zhì)數(shù)量遠(yuǎn)多于耗盡的蛋白質(zhì)的數(shù)量。HSA 的加標(biāo)，無論是 5 倍還是 20 倍，都沒有太大改變富集和耗盡蛋白的數(shù)量，因為 NPC 對 HSA 加標(biāo)的耐受性優(yōu)異。然而，隨著血清濃度從 5% 增加到 50%，富集蛋白的數(shù)量減少，而 HSA 、 LTF 和 C1QA 的峰值分別增加耗盡蛋白的數(shù)量（圖 5G-I）。總體而言，我們的加標(biāo)實驗表明，NPC 對高豐度蛋白質(zhì)表現(xiàn)出顯著的耐受性，包括那些與宿主免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。
2.5 HSA 通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用促進(jìn)冠蛋白的多樣性
HSA 是血清中最豐富的蛋白質(zhì)。據(jù)信，HSA 會干擾 MS 中低豐度蛋白質(zhì)的鑒定，HSA 的耗竭將增強(qiáng)血清蛋白質(zhì)組學(xué)的深度。然而，HSA 的耗竭是一把雙刃劍，因為它也是血清中非常重要的載體蛋白。我們相信 PPI 在 NPC 形成過程中增強(qiáng)血清蛋白質(zhì)組學(xué)深度方面也起著關(guān)鍵作用。為了驗證這一概念，再次分別分析了與 HSA、LTF 和 C1QA 相關(guān)的蛋白質(zhì)（圖 5J-L;圖 S18，支持信息）。隨著 HSA 的加標(biāo)折疊增加，高豐度蛋白（如 APOE 和 VTN）和低豐度蛋白（如 CP、SHBG、HPX 和 SERPINA1）都顯示出蛋白質(zhì)等級的增加（圖 5J;圖 S18A，支持信息）。LTF 和 C1QA 不是載體蛋白，其相關(guān)蛋白不如 HSA 多。只有少數(shù)相關(guān)蛋白，如 PRTN3 和 CP 顯示出增加趨勢以及由于 PPI 引起的刺突增加倍數(shù)（圖 5K，L;圖 S18B，c，支持信息）。我們之前的數(shù)據(jù)表明，HSA 在 NPC 中占比不到 5%，表明 HSA 顯著減少但未完全耗盡（圖 3F）。為了進(jìn)一步闡明 HSA 在 CeO2 NPC 病例中的作用，我們分析了 CeO2 NPC 的冠蛋白。如圖 S19（支持信息）所示，隨著血清中引入更多的 HSA，一些可能與 HSA 相關(guān)的蛋白質(zhì)，如 ANPEP、SHBG 和 SPARC，顯示出增加。PPI 網(wǎng)絡(luò)證實許多蛋白質(zhì)與 HSA 具有顯著相關(guān)性。因此，HSA 可以通過 PPI 顯著促進(jìn)富集蛋白 corona 作為載體蛋白的多樣性。
2.6 結(jié)合親和力、蛋白質(zhì)濃度和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，作為 Corona 蛋白譜的決定因素
為了進(jìn)一步了解上述蛋白質(zhì)的結(jié)合特征，使用 SPR 檢測每種蛋白質(zhì)與 NP 的結(jié)合親和力。結(jié)合親和力從高到低的順序是 LTF （KD = 74.2 pM）、C1QA （KD = 0.9 nM） 和 HSA （KD = 8.9 nM）（圖6A-C）。此外，我們建立了一種三蛋白測定法來詢問 NPC 形成過程中蛋白質(zhì)結(jié)合親和力和濃度的關(guān)系。對于單蛋白測定，NPC 的吸附蛋白質(zhì)量為 0.63 nmol （LTF）、0.52 nmol （C1QA） 和 0.48 nmol （HSA）（圖 S20，支持信息）。吸附蛋白數(shù)量的順序與相應(yīng)蛋白的結(jié)合親和力非常匹配，表明結(jié)合親和力決定了蛋白對 NP 的吸附。
圖 6 蛋白質(zhì)競爭揭示了具有不同結(jié)合親和力的蛋白質(zhì)的不同結(jié)合方式。
A-C） SPR 反應(yīng)單位 （RU） 作為使用固定化 HSA （A）、LTF （B） 和 C1QA （C） 作為受體的 NPs 隨時間變化。應(yīng)用一個位點結(jié)合模型擬合數(shù)據(jù)并計算解離常數(shù)。分析表明，Fe3O4@SiO2 NPs 與 HSA、LTF 和 C1QA 結(jié)合，HSA 的解離常數(shù) KD = 8.9 n M，LTF 的 KD = 74.2 pM，C1QA 的 KD = 0.9 nM。D，E） 從三蛋白測定的 NPC 中檢索的蛋白質(zhì)的 SDS-PAGE 凝膠 （D） 和質(zhì)量數(shù) （E）。F） HSA（粉紅色）、LTF（藍(lán)色）和 C1QA（綠色）的歸一化光譜計數(shù) （NSpC） 與 HSA 起始量 （%） 的函數(shù)關(guān)系。G–I） LTF （G） 、HSA （H） 和 C1QA （I） 的多變量分析。氣泡顏色根據(jù) FC 值（NSpC 與輸入）分級。
然后，考慮到 HSA 是血清中最豐富的蛋白質(zhì)，將總蛋白質(zhì)輸入設(shè)置為 1 nmol，LTF 等于三蛋白模型中的 C1QA。從 HSA：LTF：C1QA = 1：1：1 開始，HSA 分別從 33.3% 增加到 71.4% （5：1：1）、92.6% （25：1：1）、98.4% （125：1：1） 和 99.7% （625：1：1）。因此，從 1：1：1 到 5：1：1 的比例，結(jié)合親和力似乎在 NPC 的形成中起主要作用。在 SDS-PAGE 中觀察到明顯的 LTF 和 C1QA 條帶（圖 6D）。然而，當(dāng) HSA 從 92.6% 增加到 98.4% 和 99.7% 時，觀察到濃度在 NPC 的形成中起主要作用，因為 HSA 波段變得更加突出。圖 6E 表明吸附蛋白質(zhì)的質(zhì)量逐漸減少，然后達(dá)到平臺期。這可能歸因于 LTF 開始時的高結(jié)合親和力和高分子量。當(dāng) HSA 主導(dǎo)輸入時，吸附的蛋白質(zhì)質(zhì)量將不再減少。因此，我們的三蛋白模型證明了結(jié)合親和力和濃度在 NPC 形成中的相關(guān)性。廈門普睿邁格生物科技有限公司提供高深度蛋白組學(xué)富集用蛋白冠磁珠（http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/8096211554.html）。
為了確定 NPC 的組成，使用 LC-MS/MS 表征吸附在 NPC 上（結(jié)合）的蛋白質(zhì)量，并定量為歸一化光譜計數(shù) （NSpC），該百分比通過使用相應(yīng)的 MW 對已鑒定蛋白質(zhì)的光譜計數(shù)進(jìn)行歸一化計算。[33]如圖 6F 所示，LTF 因其高結(jié)合親和力和 MW 而以 1：1：1 的比例占 NSpC 的 90.34%。盡管 C1QA 的 MW 低于 HSA，但由于 C1QA 的結(jié)合親和力更高，C1QA 的 NSpC 仍高于 HSA。然而，隨著 HSA 的輸入量從 33.3% 增加到 99.7%，HSA 在 NPC 中的吸附顯著增加，而 LTF 和 C1QA 的吸附減少。該結(jié)果表明，當(dāng) HSA 極高時，無論結(jié)合親和力如何，濃度都將主導(dǎo) NPC 的譜。
為了全面比較三種蛋白質(zhì)競爭性吸附的動態(tài)行為，計算了 FC 值 （NSpC vs-input）。值得注意的是，無論其輸入如何，LTF 的 FC 始終> 1，表明 LTF 是一種富集的蛋白質(zhì)（圖 6G）。然而，HSA 的 FC 始終< 1，表明 HSA 是一種耗盡的蛋白質(zhì)（圖 6H）。同樣，圖 6I 中 C1QA 的 FC 表明它是一種耗盡的蛋白質(zhì)，即使它是血清中富集的蛋白質(zhì)（圖 3C）?？傊鞍踪|(zhì)富集或耗竭是平衡結(jié)合親和力、濃度和 PPI 的結(jié)果。具有高結(jié)合親和力的蛋白質(zhì)通常是低濃度的富集蛋白質(zhì)，而低結(jié)合親和力的蛋白質(zhì)是高濃度的耗盡蛋白質(zhì)。
3 討論
以前的研究，包括那些引用 Vroman 效應(yīng)的研究，該效應(yīng)描述了血清蛋白競爭性蛋白質(zhì)吸附到表面的過程，已經(jīng)報道了 NPC 的形成。因此，我們知道 NPs 的材料、大小和表面修飾會影響蛋白冠蛋白的多樣性。蛋白質(zhì)吸附是一個動態(tài)過程，其中當(dāng) NPs 被引入血清或血漿中時，1 小時后達(dá)到平衡。通常，血清中濃度較高的蛋白質(zhì)會首先吸附到表面，然后逐漸被結(jié)合親和力較高的蛋白質(zhì)取代。較高的血清濃度通常會導(dǎo)致更多的蛋白質(zhì)吸附到 NP 表面。由于復(fù)雜的配體-蛋白質(zhì)相互作用，NP 表面的不同配體通常對蛋白質(zhì)吸附有不同的偏好。因此，配體修飾通常用于實現(xiàn)靶向相互作用。據(jù)報道，調(diào)整蛋白質(zhì)與 NP 的比例可以識別更多的蛋白質(zhì)。然而，考慮到血清的濃度和復(fù)雜性，決定蛋白冠特征的基本因素仍然不明確。以前的研究已經(jīng)獨立地對濃度、結(jié)合親和力和 PPI 的影響進(jìn)行了深入的探索。在這里，我們系統(tǒng)地研究了血清濃度、蛋白質(zhì)結(jié)合親和力以及 PPI 在 NPC 形成中的作用，以闡明這些因素之間的平衡如何通過消耗高豐度蛋白質(zhì)和富集低豐度蛋白質(zhì)來增強(qiáng) NPC 血清蛋白質(zhì)組覆蓋率。
鼻咽癌的形成類似于免疫反應(yīng)。與先天免疫和適應(yīng)性免疫相關(guān)的各種蛋白質(zhì)（包括中和抗體、補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)、免疫球蛋白等）被吸附在引入血清的 NPs 表面。值得注意的是，這些蛋白質(zhì)表現(xiàn)出濃度依賴性方式。因此，蛋白冠中豐富的免疫相關(guān)血清蛋白可以比作免疫反應(yīng)的一種體外模擬。我們的結(jié)果表明，NPC 通過消耗高豐度蛋白和富集低豐度蛋白來增強(qiáng)血清蛋白質(zhì)組覆蓋率。例如，單獨 HSA 占血清總蛋白的 ≈50%，但血清中過量的 HSA 飆升至 5 倍甚至 20 倍，并沒有通過消耗這種豐富的蛋白質(zhì)來顯著改變 NPC 的血清蛋白質(zhì)組覆蓋率。NPC 可以減少復(fù)雜血清中不堪重負(fù)的 HSA，因為它對超高豐度蛋白具有內(nèi)在耐受性。此外，LTF 和 C1QA 的加標(biāo)也顯示高豐度蛋白質(zhì)的一致消耗和低豐度蛋白質(zhì)的富集。因此，結(jié)合 HSA-蛋白質(zhì)相互作用和其他 PPI，無論高豐度蛋白質(zhì)如何，都可以維持 NPC 的深度蛋白質(zhì)組覆蓋。
為了研究結(jié)合親和力和蛋白質(zhì)濃度對 NPC 形成的影響，我們建立了單蛋白測定和三蛋白測定。在單蛋白測定中，蛋白質(zhì)吸附量完全由蛋白質(zhì)結(jié)合親和力決定。在三蛋白測定中，當(dāng)沒有高豐度蛋白時，結(jié)合親和力在 NPC 的譜中占主導(dǎo)地位。隨著高豐度蛋白質(zhì)變得突出，濃度將取代結(jié)合親和力并主導(dǎo)蛋白質(zhì)吸附。在更復(fù)雜的血清的情況下，蛋白質(zhì)結(jié)合親和力、濃度和 PPI 會在不同的蛋白質(zhì)中相互競爭。當(dāng)競爭達(dá)到平衡時，將獲得具有多種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定 NPC。因此，NPC 的形成取決于蛋白質(zhì)結(jié)合親和力、濃度和 PPI，以及這三者的平衡。
除了蛋白質(zhì)組學(xué)深度外，蛋白冠的生理特性研究在納米醫(yī)學(xué)的個性化精準(zhǔn)醫(yī)療中也非常關(guān)鍵。來自不同個體的血漿在蛋白質(zhì)類型和濃度方面存在差異，這將顯著影響蛋白冠特性。我們的蛋白質(zhì)加標(biāo)研究還促進(jìn)了對個性化蛋白冠的理解。未來對這一維度的探索將為不同個體之間蛋白冠組成的變異性提供有價值的見解，從而拓寬納米醫(yī)學(xué)臨床轉(zhuǎn)化的適用性和影響。廈門普睿邁格生物科技有限公司提供高深度蛋白組學(xué)富集用蛋白冠磁珠（http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/8096211554.html）。
最后，這項研究有一些局限性。首先，蛋白質(zhì)并不是吸附 NP 的唯一生物分子。據(jù)報道，膽固醇和磷脂酰膽堿可以調(diào)節(jié) NPC 的形成。其他生物分子，如代謝物、脂質(zhì)、DNA 和 RNA，也可能影響 NPC 的組成。因此，未來的研究可能會解決核酸、代謝物和脂質(zhì)如何介導(dǎo) NPC 的形成。其次，我們認(rèn)為 NPC 的形成是依賴于生物流體的。腦脊液、尿液、唾液和淚液在蛋白質(zhì)濃度、豐度和復(fù)雜性方面與血清不同。因此，用其他生物流體探索 NPC 的蛋白質(zhì)組覆蓋率可以作為新生物標(biāo)志物的潛在來源，并有助于更準(zhǔn)確的疾病診斷。
4 總結(jié)
總之，我們破譯了 1） 通過消耗高豐度蛋白質(zhì)和富集低豐度蛋白質(zhì)獲得更高的 NPC 血清蛋白質(zhì)組學(xué)覆蓋率，2） NPC 對復(fù)雜血清中的高豐度蛋白質(zhì)具有內(nèi)在耐受性，以及 3） 蛋白質(zhì)結(jié)合親和力、濃度和 PPI，以及這三者的平衡決定了血清中 NPC 的形成。通過我們對基本 NPC 形成的表征，我們提供了見解，從而擴(kuò)大了深入的 NPC 蛋白質(zhì)組學(xué)在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和疾病診斷中的應(yīng)用。
致謝：Q.L. 和 M.W. 對這項工作做出了同等貢獻(xiàn)。這項工作得到了國家重點研發(fā)計劃（2022YFC3401002）、國家自然科學(xué)基金（22204144和21CAA02059）、浙江省自然科學(xué)基金（YXD24B0402）和浙江省“先鋒”和“領(lǐng)雁”研發(fā)計劃（2023SDYXS0001）的支持。廈門普睿邁格生物科技有限公司提供用于形成蛋白冠的磁性納米粒子。作者承認(rèn)了中國科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)研究所 （HIM） 共享儀器核心設(shè)施中 LC-MS/MS 和場發(fā)射透射電子顯微鏡的使用。
- 上一篇：下一代納米顆粒蛋白冠表征方法展望 2025/4/5
- 下一篇：蛋白冠在推進(jìn)血漿蛋白質(zhì)組學(xué)中的作用 2025/3/16