下一代納米顆粒蛋白冠表征方法展望
He, W., Wu, W., Li, Y., Liu, Q., Ren, P., Liu, H., & Chen, F. (2025). Next generation nanoparticle protein corona characterization methods. Nanomedicine, 1–3. https://doi.org/10.1080/17435889.2025.2460962
納米顆粒 （NP） 因其獨特的特性而徹底改變了醫(yī)學、電子和材料科學。然而，生物醫(yī)學應用中的一個關鍵挑戰(zhàn)是蛋白冠 （PC） 的形成，這會影響 NP 在體內(nèi)的行為和功效，NPs 在各種介質(zhì)中的演變和意外暴露過程中 PC 的意外形成對納米顆粒的毒性和安全性有重大影響。由低親和力軟蛋白冠和高親和力硬蛋白冠組成的 PC 響應生物環(huán)境而發(fā)生動態(tài)變化，使納米粒子相互作用的可預測性復雜化。因此，開發(fā)用于 PC 表征的實時方法對于控制和優(yōu)化 NP 行為、推進個性化醫(yī)療和靶向治療至關重要。
傳統(tǒng)的 PC 表征方法，如凝膠電泳、質(zhì)譜和表面等離子體共振，為了解蛋白冠的組成和結構提供了有價值的見解，但這些方法通常無法在實時體內(nèi)條件下捕捉蛋白質(zhì)-納米顆粒相互作用的動態(tài)和異質(zhì)性。例如，它們通常依賴于通過離心從培養(yǎng)基中分離 NP 蛋白復合物，這會導致軟蛋白冠的損失。因此，這些技術無法完全反映生物系統(tǒng)中的實際 PC“指紋”。
新一代技術通過實現(xiàn)實時原位分析來避免與分離步驟相關的干擾和蛋白質(zhì)損失。這些創(chuàng)新可以更準確、更全面地了解 PC 的形成及其與生物系統(tǒng)的復雜相互作用。這一進展的一個主要例子是 Niu 等人的工作，他們開發(fā)了一種新穎的原位方法，用于使用納流式細胞術 （NanoFCM） 在單納米顆粒水平上定量分析納米顆粒-蛋白質(zhì)相互作用，通過整合雙熒光定量技術，NanoFCM 可以提供有關血清等復雜生物基質(zhì)中蛋白質(zhì)吸附動力學和納米顆粒聚集的實時數(shù)據(jù)。這種方法使研究人員不僅可以監(jiān)測蛋白質(zhì)吸附，還可以監(jiān)測人血清中納米粒徑的演變。這代表了納米顆粒-蛋白質(zhì)相互作用的定量、原位表征的重大進步，有望為設計更有效的納米藥物提供有價值的見解。Zentel 等人使用不對稱流場-流式分離從人血漿中分離 PC/NP 復合物，并使用 SDS-PAGE 和無標記蛋白質(zhì)組學表征富集的蛋白質(zhì)。這種方法可以防止離心過程中的 PC 損失。結果表明，盡管在大多數(shù)情況下有效緩解 PC 形成存在挑戰(zhàn)，但并非所有納米顆粒都會發(fā)展出顯著的 PC。具體來說，PEG、pSar 和 pHPMA 包被的聚合物納米載體表現(xiàn)出最小的蛋白質(zhì)吸附，解釋了它們延長的循環(huán)時間和潛在的臨床應用 。
對軟 PC 成分的實時分析提出了一個重大問題。由于時間尺度較長，以前的方法無法精確捕捉其動態(tài)變化。值得注意的是，Zhang 等人在納米顆粒中開發(fā)了一種納米粒子光催化接近標記 （nano-PPL） 技術，用于 PC 的原位標記，并在二級研究了 PC 的快速形成機制，納米 PPL 技術利用載有 Ce6 催化劑和生物素-酚探針的核殼納米顆粒進行快速、精確的原位 PC 標記。與傳統(tǒng)離心法（>30 秒）相比，納米 PPL 顯著提高了納米粒子-蛋白質(zhì)相互作用的時間分辨率，持續(xù)時間精度低至約 5 秒。作者發(fā)現(xiàn)，照射光敏探針 Ce6 可以激活生物素酚，從而誘導蛋白質(zhì)的生物素化。自由基轉移是鄰近標記的基本原理。因此，活化的生物素酚可以自由基的形式與周圍的蛋白質(zhì)反應，并將生物素標記附著在它們上面。最后，這些生物素標記的蛋白質(zhì)可以使用鏈霉親和素包被的磁珠進行分離，并通過液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜進行鑒定和定量。在另一項研究中，研究人員使用 IRDye 680 NHS 酯快速標記蛋白質(zhì)以對 PC 進行體內(nèi)追蹤，從而能夠觀察其動態(tài)變化，原子力顯微鏡具有納米級分辨率，特別適合分析單分子生物共軛過程。這兩種技術的集成在 PC 動力學的原位監(jiān)測方面具有巨大的潛力，可能代表一種很有前途的下一代表征方法。
在另一項研究中，Baimanov 等人開發(fā)了一種基于生物層干涉法 （BLI） 的快速捕魚策略，為納米顆粒表面的 PC 建立了一種原位和動態(tài)分析方法，一旦手性 NP 與其連接，IgG 預包被的生物傳感器在生物樣品中孵育以形成 PC。用不同濃度的洗滌緩沖液洗脫和分離軟 PC 和硬 PC 的蛋白質(zhì)，并通過質(zhì)譜鑒定。這種方法允許實時監(jiān)控 PC 的形成、交換和解離過程。通過對多層 PC 的組分進行原位和快速洗脫，它實現(xiàn)了軟硬 PC 的高效分離、鑒定和時間分辨動力學研究。這種原位分析方法也適用于超小、低密度納米顆粒的 PC 研究。此外，該研究團隊系統(tǒng)總結了過去幾年開創(chuàng)的納米 PC 分析和表征方法，并將其匯編成一本詳細而全面的實驗手冊，優(yōu)化的工作流程涵蓋了所有過程，例如納米生物分子蛋白冠的形成、制備、定量、成分鑒定、原位表征和動態(tài)相互作用。該技術解決方案結合了多種不同的分析方法，例如電子顯微鏡、質(zhì)譜、同步輻射分析方法、分子相互作用分析和分子動力學模擬，有助于全面和系統(tǒng)地表征納米生物分子蛋白冠的物理化學性質(zhì)、成分和原位動力學相互作用。該實驗手冊詳細總結了上述分析方法的優(yōu)化實施方案，為納米生物分子蛋白冠的綜合分析提供了有價值的研究策略。它不僅適用于闡明納米生物分子蛋白冠的形成、進化和動態(tài)相互作用過程，而且為揭示納米生物界面對納米材料復雜的化學和生物效應的機制提供了有效的研究工具，在納米科學、生物醫(yī)學、毒理學和環(huán)境科學等眾多研究領域具有重要的應用價值。
PC 的體內(nèi)表征長期以來一直是一個基本未被探索的領域，但它在確定 NP 在生物系統(tǒng)中的行為方面起著至關重要的作用。最近，Latreille 等人提出了一種新的理論框架，用于定量評估蛋白質(zhì)對 NPs 的原位吸附，并在熒光成像模式下使用差分動態(tài)顯微鏡 （DDM） 監(jiān)測 NPs 的聚集 [DDM 可以同時監(jiān)測 NP 的大小和聚集，通過量化這種聚集，它可以應用于復雜的蛋白質(zhì)混合物。結果表明，蛋白質(zhì)吸附可以觸發(fā)顆粒聚集，并且該方法可以進一步量化形成的聚集結構。研究表明，蛋白質(zhì)對聚苯乙烯 NPs 的親和力與顆粒濃度有關。對于復雜的蛋白質(zhì)混合物，本研究發(fā)現(xiàn) PC 的組成隨血清蛋白的稀釋而變化，從而證明了從未在 NP 上原位定量評估過的 Vroman 效應。實驗結果表明，DDM 可以監(jiān)測 PC 在體內(nèi)的變化。斑馬魚幼蟲中 PC 的組成隨著時間的推移發(fā)生顯著變化，進一步證實了 PC 的動態(tài)性質(zhì)。本文為納米顆粒與生物分子相互作用的研究提供了一種新的定量分析工具，實驗驗證了其在體外和體內(nèi)應用中的有效性，為納米醫(yī)學的發(fā)展提供了重要的參考。盡管 DDM 在研究納米顆粒和蛋白質(zhì)之間的相互作用方面具有顯著優(yōu)勢，但它也面臨著一些限制，例如高濃度樣品、非球形顆粒、熒光猝滅、動態(tài)范圍、實驗條件和數(shù)據(jù)處理方面的挑戰(zhàn)。在應用 DDM 時，應根據(jù)具體的研究對象和條件進行適當?shù)恼{(diào)整和優(yōu)化。
使用計算機模擬預測納米材料上的 PC 的研究是一個活躍的研究領域。Huzar 等人表明 DNA 納米結構的工程改造可以通過非 DNA 修飾來實現(xiàn)，并且在較小程度上可以通過改變 DNA 結構本身來實現(xiàn)，他們的機器學習模型在預測蛋白質(zhì)吸附在 DNA 納米結構上的準確率達到了 92%。該 AI 工具可幫助研究人員預測蛋白冠組成，優(yōu)化生物物理和生物醫(yī)學應用的 DNA 納米結構設計。然而，需要對高分辨率成像和生化分析進行進一步研究，以補充機器學習預測。
用于 PC 的下一代表征方法的開發(fā)為推進納米醫(yī)學和納米生物技術領域帶來了巨大的前景。然而，這些下一代表征技術的開發(fā)必須解決幾個關鍵挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括克服高成本帶來的限制、對先進設備的需求以及實時捕獲動態(tài)變化的困難。此外，體內(nèi) PC 的原位檢測仍然是一項艱巨的挑戰(zhàn)。為了解決這些障礙，各種新興技術的組合，如實時成像、多模態(tài)傳感和先進的計算工具，有望帶來突破。另一個重要的考慮因素是來自各個領域的研究人員之間需要跨學科合作，包括納米材料、生物學、物理學和計算科學。此類合作對于開發(fā)更有效和通用的表征技術至關重要。隨著我們朝著這個方向前進，不同技術的整合無疑將增強我們對 PC 的理解，從而為針對廣泛疾病的更加個性化和有針對性的治療鋪平道路。普睿邁格提供蛋白冠富集磁珠 http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/8096211554.html
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