視角：去中心化的納米顆粒蛋白冠分析可能誤導(dǎo)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)
Ali Akbar Ashkarran, Decentralized nanoparticle protein corona analysis may misconduct biomarker discovery, Nano Today, Volume 62, 2025, 102745,
ISSN 1748-0132, https://doi.org/10.1016/j.nantod.2025.102745.
摘要
蛋白質(zhì)/生物分子蛋白冠 （PC） 是納米顆粒 （NP） 暴露于血液或血清等生物體液后在納米顆粒 （NP） 表面形成和進(jìn)化的生物層。PC 的組成反映了生物環(huán)境，并受生物體疾病狀態(tài)的影響。因此，PC 可以用作生物標(biāo)志物庫(kù)，其中疾病特異性蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)吸附模式的改變表明存在癌癥、心血管疾病或感染等疾病。研究人員越來(lái)越多地利用 NPs-蛋白質(zhì)相互作用來(lái)發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)志物，希望將 PC 用作病理狀態(tài)的分子指紋，與傳統(tǒng)方法相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。NP 為蛋白質(zhì)結(jié)合提供高表面積，充當(dāng)通常難以檢測(cè)的低豐度蛋白質(zhì)的富集工具。此外，特定蛋白質(zhì)與 NPs 表面之間的相互作用可以反映蛋白質(zhì)構(gòu)象或功能的改變，為疾病病理生理學(xué)提供進(jìn)一步的見解。
圖 1.體外和體內(nèi)暴露于生物體液中 PC 形成的示意圖以及使用 LC-MS/MS 分析 PC 成分。
迄今為止，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 （LC-MS/MS） 仍然是表征 PC 和鑒定具有潛在診斷價(jià)值的此類蛋白質(zhì)的主要方法。然而，質(zhì)譜法在多大程度上促進(jìn)了評(píng)估 PC 組成的技術(shù)變化，以及這些蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果如何影響納米生物界面的解釋，在很大程度上仍未得到探索。為了解決這一問(wèn)題并強(qiáng)調(diào)我們工作的新穎性，我們?cè)谝灾刑砑恿嗽敿?xì)的討論，強(qiáng)調(diào)了分散式蛋白質(zhì)蛋白冠 （PC） 分析的獨(dú)特方面，這在以前的文獻(xiàn)中沒有得到充分探討。具體來(lái)說(shuō)，我們的研究側(cè)重于跨多個(gè)平臺(tái)的分散工作流程帶來(lái)的方法挑戰(zhàn)，強(qiáng)調(diào)需要協(xié)調(diào)的協(xié)議來(lái)確保生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的可重復(fù)性和可靠性。
據(jù)報(bào)道，從生物液體的處理和儲(chǔ)存，到 NPs 制備，方法學(xué)上的不一致會(huì)引入顯著的可變性，從而影響蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的準(zhǔn)確性。這些不一致會(huì)導(dǎo)致誤解，最終阻礙納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用的臨床轉(zhuǎn)化。此外，物理化學(xué)性質(zhì)（例如，大小、電荷、表面化學(xué)等）的表征不足嚴(yán)重影響了納米生物界面數(shù)據(jù)的解釋。在這里，我們討論了這種可變性在分散的環(huán)境中進(jìn)一步加劇，其中樣品制備、儀器、數(shù)據(jù)收集和分析在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都采用不同的協(xié)議。在影響納米生物界面數(shù)據(jù)的各種參數(shù)中，這項(xiàng)工作專門為 PC 成分的分散分析如何影響生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)新的視角，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化方法提出了可行的解決方案。
隨著 PC 分析的分散方法變得越來(lái)越普遍，這一研究領(lǐng)域面臨著重大挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)可能導(dǎo)致在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（如生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)）得出誤導(dǎo)性結(jié)論甚至不當(dāng)行為。分散式 NP 的 PC 分析，即跨多個(gè)核心設(shè)施或平臺(tái)進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)收集，存在數(shù)據(jù)多樣性等缺點(diǎn)。事實(shí)上，這些平臺(tái)在方法、樣品制備和數(shù)據(jù)解釋方面的不一致威脅著生物標(biāo)志物鑒定工作的可重復(fù)性和有效性。在這種觀點(diǎn)中，我們認(rèn)為分散式 NP 的 PC 分析可能會(huì)引入可變性和偏差，導(dǎo)致不正確的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，從而可能損害基于納米粒子的診斷技術(shù)的未來(lái)。
質(zhì)譜分析是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵要素
MS 在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樗軌蛞愿哽`敏度和特異性識(shí)別、定量和表征各種生物分子，特別是檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)或肽。這在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中特別有用，因?yàn)樯矬w液中可能以非常少量的方式存在潛在的疾病標(biāo)志物。此外，MS 可以與其他組學(xué)技術(shù)（例如基因組學(xué)、代謝組學(xué)）集成，以創(chuàng)建多組學(xué)數(shù)據(jù)集，通過(guò)將遺傳變異與蛋白質(zhì)表達(dá)和代謝途徑聯(lián)系起來(lái)來(lái)增強(qiáng)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。MS 是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)不可或缺的一些關(guān)鍵要素，包括但不限于蛋白質(zhì)組范圍的鑒定、蛋白質(zhì)豐度的定量、翻譯后修飾 （PTM）、生物標(biāo)志物驗(yàn)證和多重檢測(cè)能力。這對(duì)于生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要，用于檢測(cè)可能以低濃度存在的疾病相關(guān)蛋白質(zhì)，從而提供健康狀態(tài)與患病狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)的整體視圖。此外，LC-MS/MS 可以對(duì)蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行定量分析，從而深入了解蛋白質(zhì)水平如何隨特定疾病、治療或環(huán)境因素而變化。此外，無(wú)標(biāo)記定量或同量異位標(biāo)記（例如，串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽 （TMT） 或用于相對(duì)和絕對(duì)定量的同量異位標(biāo)簽 （iTRAQ）方法使研究人員能夠比較多種條件下的蛋白質(zhì)水平，這是識(shí)別用于診斷或預(yù)后應(yīng)用的潛在生物標(biāo)志物的關(guān)鍵。此外，LC-MS/MS 可以檢測(cè)磷酸化、糖基化和泛素化等 PTM，這些通常在疾病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。
最近的進(jìn)展證明了 PC 分析在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和癌癥診斷方面的變革潛力。Wang 等人開發(fā)了蛋白質(zhì)釣魚方法，將 NPs 的 PC 形成與機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合，以富集低豐度蛋白質(zhì)并耗盡高豐度蛋白質(zhì)，對(duì)早期非小細(xì)胞肺癌的診斷準(zhǔn)確率達(dá)到 91.38%。同樣，Xie 等人引入了一種血清蛋白變性策略來(lái)增強(qiáng)蛋白質(zhì)組學(xué)深度，從而能夠識(shí)別區(qū)分良惡性肺結(jié)節(jié)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。雖然這些研究強(qiáng)調(diào)了開發(fā)創(chuàng)新工作流程以增強(qiáng)血清蛋白質(zhì)組學(xué)的重要性，但重要的是要認(rèn)識(shí)到 PC 分析中的分散工作流程，加上由于非標(biāo)準(zhǔn)化方案而導(dǎo)致的核心設(shè)施之間的差異，可能會(huì)引入不一致，從而破壞生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的可靠性，并可能導(dǎo)致誤解。
基于 MS 的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的潛在陷阱
用于生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的 NPs PC 分析面臨重大挑戰(zhàn)，部分原因是動(dòng)態(tài)范圍寬（即 22 種蛋白質(zhì)占血漿蛋白重量的 99%），以及血漿中存在不同的蛋白質(zhì)亞型。此外，從軟 PC 到硬 PC 的轉(zhuǎn)變涉及競(jìng)爭(zhēng)性吸附，并受幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)的影響，包括蛋白質(zhì)濃度、結(jié)合親和力和 NP 的物理化學(xué)性質(zhì)。在這方面，由于 NPs 表面 PC 形成的動(dòng)態(tài)性質(zhì)，NPs 的PC 具有富集人血漿蛋白質(zhì)組的潛力。在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中，PC 的關(guān)鍵方面之一是低豐度生物標(biāo)志物的富集，這些生物標(biāo)志物以非常低的濃度存在于人血漿中，并且可以在 PC 層中富集。這種富集有助于檢測(cè)和鑒定可能難以直接從復(fù)雜生物基質(zhì)中檢測(cè)的稀有生物標(biāo)志物。除了 NP 的物理化學(xué)性質(zhì)外，生物液體中存在的代謝物、脂質(zhì)、維生素和其他類型的小生物分子還可以與這些液體中的蛋白質(zhì)相互作用并影響它們的行為，包括它們對(duì) NP 的吸附并產(chǎn)生獨(dú)特的 PC 模式。最近報(bào)道，高水平的膽固醇作為涉及各種人類疾?。ɡ缧难芗膊。┑闹匾x物，由于在膽固醇存在下蛋白質(zhì)與 NPs 的結(jié)合親和力發(fā)生變化，導(dǎo)致 PC 富含載脂蛋白和減少補(bǔ)體蛋白。在解決 NPs 的PC 的復(fù)雜性時(shí)，我們之前證明，調(diào)節(jié) PC 組成可顯著提高血漿蛋白質(zhì)組的檢測(cè)深度，從而能夠捕獲具有高診斷價(jià)值的稀有和低豐度蛋白質(zhì)。
在這方面，NP的 PC 等新興技術(shù)對(duì)于降低生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中給定生物流體的生物復(fù)雜性至關(guān)重要。然而，鑒定穩(wěn)定且可重現(xiàn)的 PC 組成和/或蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在很大程度上取決于 MS 工作流程。例如，最近的研究結(jié)果表明，當(dāng)使用不同的方法、方案、LC-MS/MS 儀器和原始數(shù)據(jù)處理時(shí)，相同的 NP的 PC 結(jié)果在不同的蛋白質(zhì)組學(xué)中心中表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性，并且無(wú)法在獨(dú)立研究中輕松比較 PC 結(jié)果。當(dāng)生物標(biāo)志物結(jié)果的可重復(fù)性是一個(gè)持續(xù)的挑戰(zhàn)時(shí)，這是臨床領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。換句話說(shuō)，在一項(xiàng) PC 研究中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)/生物標(biāo)志物在后續(xù)調(diào)查中或應(yīng)用于不同的患者群體時(shí)不一定有效。因此，迫切需要開發(fā)一種獨(dú)特的 PC 分析集中式標(biāo)準(zhǔn)方案，以最大限度地減少最終可用于臨床應(yīng)用的 PC 結(jié)果的異質(zhì)性。Zhang 等人最近發(fā)表的方案概述了在生物和環(huán)境背景下對(duì) NP 進(jìn)行 PC 分析的綜合框架。雖然研究的重點(diǎn)是為不同系統(tǒng)的 PC 分析開發(fā)通用工作流程，但我們的研究強(qiáng)調(diào)了分散式工作流程對(duì)使用 LC-MS/MS 進(jìn)行 PC 表征的影響，以及這些復(fù)雜性如何誤導(dǎo)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。我們專門解決了由非標(biāo)準(zhǔn)化方案引起的核心設(shè)施和蛋白質(zhì)組學(xué)中心之間的變異性問(wèn)題，這一挑戰(zhàn)迄今為止尚未得到充分承認(rèn)。
這里的主要重點(diǎn)是解決與分析 NP 的硬 PC 相關(guān)的挑戰(zhàn)。雖然 LC-MS/MS 是一種強(qiáng)大的技術(shù)，可為硬 PC 分析提供高靈敏度和特異性，但當(dāng)應(yīng)用于 NP 的軟 PC 時(shí)，它存在明顯的局限性。質(zhì)譜分析所需的凈化過(guò)程通常會(huì)破壞 NP 的微妙平衡，導(dǎo)致形成軟 PC 的松散結(jié)合蛋白質(zhì)丟失。這損害了準(zhǔn)確區(qū)分軟 PC 層和硬 PC 層的能力。盡管已經(jīng)開發(fā)了先進(jìn)的技術(shù)，如場(chǎng)流分離、基于原位生物膜干涉測(cè)量法 （BLI） 的捕撈策略、多參數(shù)表面等離子體共振 （MP-SPR Navi? LayerSolver?） 和熒光相關(guān)光譜 （FCS），用于原位研究軟 PC 的形成，但這些方法通常難以有效地將軟 PC 與硬 PC 隔離或緩解污染和動(dòng)態(tài)等問(wèn)題變異性。此外，離心是分離 PC 包被的 NP 的最廣泛使用的方法，在這方面尤其有限，因?yàn)樗饕蛛x硬 PC，而由松散連接的蛋白質(zhì)組成的軟 PC 通常會(huì)在此過(guò)程中丟失。因此，分離和研究軟 PC 仍然是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，需要?jiǎng)?chuàng)新的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)解決其脆弱性以及下游 LC-MS/MS 分析帶來(lái)的額外復(fù)雜性。
不當(dāng)行為的來(lái)源
使用 MS 進(jìn)行 PC 分析和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的整個(gè)程序包括三個(gè)核心階段，包括樣品制備、使用 LC-MS/MS 系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量和數(shù)據(jù)分析。第一階段的樣品制備有幾個(gè)核心步驟，例如蛋白質(zhì)濃度測(cè)量、變性、還原、烷基化、蛋白質(zhì)消化和脫鹽/清潔，乍一看似乎相對(duì)簡(jiǎn)單，如圖2所示。然而，這可能只是冰山一角，這些步驟中的每一個(gè)都有其他幾個(gè)多步驟，其中包含許多實(shí)驗(yàn)和技術(shù)細(xì)節(jié)，這些細(xì)節(jié)可能因核心設(shè)施而異（在圖2中示意性地顯示為冰山深度），并且在 PC 分析過(guò)程中需要仔細(xì)考慮以發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物。例如，最近表明，在 NP 的 PC 分析期間，各個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)中心在樣品制備、儀器、定量方法、搜索參數(shù)以及原始數(shù)據(jù)處理和報(bào)告方面存在許多差異，這導(dǎo)致最終相同 NP 的 PC 結(jié)果存在顯著差異（即，美國(guó) 17 個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)中心之間只有 1.8% 的共享蛋白質(zhì)）這些變化從最初的蛋白質(zhì)消化步驟開始，一直持續(xù)到分析的最新步驟（例如，原始數(shù)據(jù)處理），一旦積累，最終會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果的復(fù)雜分歧和數(shù)據(jù)不一致，如下所示
圖 2.使用質(zhì)譜法對(duì)看似簡(jiǎn)單的 NP PC 分析背后的復(fù)雜性的示意圖。
該圖強(qiáng)調(diào)，雖然分析 NP 的 PC 組成的工作流程可能看起來(lái)很簡(jiǎn)單，但它只是“冰山一角”。表面之下隱藏著顯著的復(fù)雜性，包括不同的樣品制備方法、LC-MS/MS工作流程的變化（例如，儀器、色譜和質(zhì)量分析儀）以及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索參數(shù)（例如，PTM和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR））。這些因素在蛋白質(zhì)鑒定中引入了巨大的可變性，可能會(huì)影響關(guān)鍵的納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用，例如生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，在這些應(yīng)用中，研究的一致性和可重復(fù)性至關(guān)重要。（縮寫：二辛可寧酸 （BCA）、紫外可見光譜 （UV-Vis）、熒光 （Fluorom）、二硫蘇糖醇 （DTT）、三（2-羧乙基）膦 （TCEP）、β-巰基乙醇 （β-ME）、鹽酸胍 （GuHCl）、碳酸氫銨 （AMBIC）、甲酸 （FA）、十二烷基硫酸鈉 （SDS）、二硫蘇糖醇 （DTT）;碘乙酰胺 （IAA）;N-乙基馬來(lái)酰亞胺 （NEM）、氯乙酰胺 （chloro）;N-甲基硫代苯磺酰胺 （NMTS）;胰凝乳蛋白酶 （Chymotry）， Glu-C （V8 蛋白酶） （Glu-C）， 半制備流式 （semi-prep）;制備液程 （preparat））。
樣品制備
使用 LC-MS/MS 進(jìn)行 NP PC 分析時(shí)，樣品制備和蛋白質(zhì)消化成肽是關(guān)鍵步驟。兩種廣泛使用的酶解技術(shù)是磁珠上酶解和凝膠內(nèi)酶解，根據(jù)樣品類型、復(fù)雜性和所需結(jié)果，每種技術(shù)都具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和局限性。例如，一些蛋白質(zhì)組學(xué)中心從磁珠開始，而一些蛋白質(zhì)組學(xué)中心使用凝膠內(nèi)消化方法，這兩種起始方法在多大程度上影響了最終結(jié)果的差異，在很大程度上仍然未知。使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)不同的、分子量分離的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行測(cè)序，增強(qiáng)了分析蛋白質(zhì)混合物的動(dòng)態(tài)范圍，并允許在較寬的豐度范圍內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)，因?yàn)槊總€(gè)條帶的凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化產(chǎn)生的肽都是單獨(dú)測(cè)序。例如，將蛋白質(zhì)組分布在 10-20 個(gè)凝膠切片中可顯著提高分析深度，從而鑒定出更多蛋白質(zhì)并檢測(cè)適合分析復(fù)雜混合物的 PTM。此外，凝膠電泳可有效去除低分子量污染物，例如去污劑和緩沖液組分，這些污染物會(huì)阻礙質(zhì)譜測(cè)序 。
另一方面，在磁珠上消化中，蛋白質(zhì)與磁珠（例如磁珠或瓊脂糖磁珠）結(jié)合，并直接在磁珠表面消化，無(wú)需事先洗脫。磁珠上消化具有更快的制備過(guò)程（即蛋白質(zhì)直接在磁珠上消化）、更簡(jiǎn)單的工作流程、減少樣品損失并提高通量的優(yōu)勢(shì)。此外，磁珠上消化可有效捕獲低豐度蛋白質(zhì)，尤其是在親和純化實(shí)驗(yàn)中，其中目標(biāo)蛋白質(zhì)已經(jīng)富集。然而，磁珠上消化方案的蛋白質(zhì)覆蓋率較低，這些蛋白質(zhì)難以溶解或在與磁珠結(jié)合時(shí)受到空間位阻，這可能導(dǎo)致消化不完全。此外，磁珠上消化對(duì)于靶向蛋白質(zhì)研究更有效、更直接，尤其是在親和純化設(shè)置中，而凝膠內(nèi)消化提供更好的蛋白質(zhì)分辨率，可用于分析復(fù)雜樣品。
Table 1. Comparison of on-bead and in-gel digestion methods for proteomic analysis of PC-coated NPs.
| Feature | On-bead digestion | In-gel digestion |
|---|---|---|
| Sample preparation | Fast and simple; fewer steps | Labor-intensive; requires electrophoresis and excision |
| Protein identification | Lower protein coverage in complex mixtures | Higher coverage with separation of complex samples |
| Protein separation | No separation; relies on affinity enrichment | SDS-PAGE-based size separation |
| Peptide recovery | High recovery, minimal sample loss | Lower recovery due to extraction losses |
| PTMs | Suitable for PTMs, especially with affinity purification | Useful for isoforms and PTMs after gel separation |
| MS compatibility | High compatibility, fewer contaminants | Requires optimization; risk of gel contaminants |
| Applications | Affinity pull-downs, low-abundance proteins | Complex proteomes, differential expression studies |
此外，許多蛋白質(zhì)組學(xué)中心使用二硫蘇糖醇 （DTT） 或 β-巰基乙醇 （β-ME） 在變性后破壞蛋白質(zhì)內(nèi)的二硫鍵，這有助于防止蛋白質(zhì)聚集并保持蛋白質(zhì)處于變性狀態(tài)。然而，一些蛋白質(zhì)組學(xué)中心跳過(guò)了這些關(guān)鍵的制備步驟和/或?qū)?/span> DTT 和 β-ME 分別使用 1 mM 至 10 mM 和 1–10 % 的不同濃度。IAA（典型濃度為 5 mM 至 50 mM）是最常見的烷化劑之一，可與游離半胱氨酸殘基反應(yīng)，從而防止樣品制備過(guò)程中二硫鍵的重組。一些核心設(shè)施也可能單獨(dú)或組合使用三氟乙酸 （TFA） 和 FA，具體取決于實(shí)驗(yàn)的具體要求和被分析蛋白質(zhì)的性質(zhì)。與此同時(shí)，許多用于 NP PC 分析的可用方案可能會(huì)忽略這些步驟，而只是從胰蛋白酶消化開始幾個(gè)小時(shí)來(lái)消化蛋白質(zhì)。
胰蛋白酶處理是樣品制備中的關(guān)鍵步驟之一，在確定 LC-MS/MS 中蛋白質(zhì)鑒定的效率和結(jié)果方面起著至關(guān)重要的作用。優(yōu)化胰蛋白酶處理?xiàng)l件對(duì)于提高 LC-MS/MS 中蛋白質(zhì)鑒定的水平至關(guān)重要，因?yàn)樗鼤?huì)影響酶解效率、肽產(chǎn)量和 PTM 保存。關(guān)鍵因素包括酶與底物的比例、消化時(shí)間、溫度、pH 值和添加劑。例如，高酶蛋白比值和長(zhǎng)時(shí)間消化會(huì)增加切割，但可能導(dǎo)致過(guò)度消化和非特異性肽，而低比例或短消化時(shí)間則存在不完全切割的風(fēng)險(xiǎn)。而不同的蛋白質(zhì)組學(xué)中心使用各種類型的胰蛋白酶和廣泛的溫度和孵育時(shí)間進(jìn)行蛋白質(zhì)消化，這可能會(huì)影響蛋白質(zhì)切割。酶特異性、活性和切割效率的這種變化會(huì)顯著影響生成的肽的數(shù)量和類型。例如，據(jù)報(bào)道，牛胰蛋白酶產(chǎn)生更多缺失切割的肽，而豬胰蛋白酶產(chǎn)生更多的半胰蛋白酶肽。此外，在幾個(gè)切割位點(diǎn)觀察到消化動(dòng)力學(xué)的差異，這從 2 小時(shí)和 18 小時(shí)消化之間肽豐度的變化中可以看出。
此外，清潔和脫鹽條件還通過(guò)去除污染物、鹽和其他干擾物質(zhì)來(lái)顯著影響蛋白質(zhì)鑒定，這些物質(zhì)會(huì)抑制電離、降低靈敏度和模糊肽信號(hào)。LC-MS/MS 樣品制備中節(jié)省成本的清潔方法，例如減少脫鹽步驟、重復(fù)使用低質(zhì)量固相萃取 （SPE） 色譜柱、沉淀后進(jìn)行最少的清洗或使用不正確的透析膜，可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)鑒定產(chǎn)生負(fù)面影響。例如，Thermo Fisher Scientific 的一項(xiàng)研究比較了四種 MS 樣品制備方法：Pierce 試劑盒、過(guò)濾輔助樣品制備 （FASP）、AMBIC/SDS 和尿素萃取，發(fā)現(xiàn) Pierce 試劑盒方案（包括 C18 脫鹽步驟）可鑒定出最多的獨(dú)特肽和蛋白質(zhì)，以及最低的漏缺切割百分比。例如，與磁珠上或凝膠內(nèi)消化等傳統(tǒng)方法不同，FASP 使用基于過(guò)濾的方法將樣品凈化和酶消化相結(jié)合。FASP 對(duì)于處理復(fù)雜的生物樣品（如血清、血漿或細(xì)胞裂解物）特別有效，可提高肽回收率并最大限度地減少污染。它簡(jiǎn)化了工作流程，提高了可重復(fù)性，并能夠高效處理難以溶解的蛋白質(zhì)。與磁珠上和凝膠內(nèi)消化方法相比，FASP 提供了一種簡(jiǎn)化、無(wú)污染的方法，非常適合高通量研究，使其成為現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)中的關(guān)鍵工具。然而，由于離心步驟多，它可能非常耗時(shí)，并且可能需要優(yōu)化以防止低豐度蛋白質(zhì)的損失。因此，適當(dāng)平衡的脫鹽方法可以確保高肽回收率、最低污染和最佳信號(hào)質(zhì)量，這對(duì)于在 LC-MS/MS 中準(zhǔn)確且可重現(xiàn)地鑒定蛋白質(zhì)至關(guān)重要。
儀器
樣品制備后，LC 和 MS 儀器的選擇以及相應(yīng)的工作流程是第二個(gè)關(guān)鍵步驟，在確定蛋白質(zhì)鑒定的深度和準(zhǔn)確性方面起著至關(guān)重要的作用。關(guān)鍵因素包括色譜柱類型和粒徑，其中高分辨率色譜柱可增強(qiáng)分離效果，但會(huì)增加運(yùn)行時(shí)間和分析成本，而標(biāo)準(zhǔn)色譜柱可能有助于鑒定高豐度蛋白質(zhì)。此外，色譜規(guī)模起著至關(guān)重要的作用，納質(zhì)譜相色譜對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的靈敏度更高，而標(biāo)準(zhǔn)液相色譜更穩(wěn)定，但靈敏度較低。此外，較長(zhǎng)的梯度可改善復(fù)雜蛋白質(zhì)的分離，但較短的梯度會(huì)耗費(fèi)時(shí)間，并且較短的梯度可能會(huì)引入共洗脫，因此更適合豐度肽。此外，多維液相色譜（如 2D-LC 或分級(jí)分離）提高了蛋白質(zhì)組覆蓋率，但需要大量的設(shè)置，而單維液相色譜速度更快，但不太全面。除了影響靈敏度和回收率的樣品上樣和進(jìn)樣方法（例如，直接進(jìn)樣與捕集洗脫法）外，流動(dòng)相組成的其他幾個(gè)參數(shù)（例如緩沖液選擇和 pH 控制）也可能影響肽保留。
液相色譜分離后，質(zhì)譜儀首先測(cè)量完整肽（母離子）的質(zhì)荷比 （m/z）。然后，選定的肽通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離 （CID）、高能碰撞解離 （HCD） 或電子轉(zhuǎn)移解離 （ETD） 等技術(shù)進(jìn)行碎裂，將母離子分解成更小的碎離子以進(jìn)行詳細(xì)分析。每種碎裂方法都會(huì)影響可檢測(cè)、鑒定和定量的肽的范圍和類型，從而對(duì)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生獨(dú)特的影響。不同的質(zhì)量分析器（例如 orbitrap、Time of Flight （TOF） 或離子阱）的分辨率和靈敏度不同，影響了低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)，而低豐度蛋白質(zhì)通常是關(guān)鍵的生物標(biāo)志物。例如，高分辨率質(zhì)量分析器（例如 orbitrap）可提供低豐度肽的精確鑒定和詳細(xì)的 PTM 表征;它可能適用于復(fù)雜樣品中豐度較高的蛋白質(zhì)。雖然低分辨率質(zhì)量分析儀（例如離子阱）更實(shí)惠、更快速，但分辨率可能有限，這反過(guò)來(lái)會(huì)阻礙密切相關(guān)的肽和低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)，從而可能偏倚生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。因此，在復(fù)雜樣品（如 PC 包被的 NP）中，選擇正確的碎裂技術(shù)或結(jié)合多種方法可以減少這種偏差，有助于確保更全面、更準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物譜。
數(shù)據(jù)分析
最后一個(gè)階段會(huì)顯著促進(jìn)蛋白質(zhì)和肽的鑒定，并在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中產(chǎn)生偏差，即用于 LC-MS/MS 原始數(shù)據(jù)處理和分析的方法和途徑。這些關(guān)鍵步驟包括但不限于數(shù)據(jù)預(yù)處理算法、識(shí)別閾值和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、定量方法（例如，無(wú)標(biāo)記和標(biāo)記定量）、歸一化和縮放技術(shù)、統(tǒng)計(jì)分析和顯著性閾值、生物信息學(xué)和通路分析工具。例如，用于降噪、峰拾取和對(duì)齊的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法會(huì)影響保留或丟棄哪些信號(hào)，從而在原始 LC-MS/MS 數(shù)據(jù)分析過(guò)程中產(chǎn)生蛋白質(zhì)鑒定偏差。靈敏度較低或過(guò)于激進(jìn)的預(yù)處理可能會(huì)消除低強(qiáng)度信號(hào)，并可能影響低豐度肽的檢測(cè)，這些肽通常是關(guān)鍵的生物標(biāo)志物。嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)和參考數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇（例如 Uniport 和 Proteome Discoverer）會(huì)影響蛋白質(zhì)鑒定。最近表明，實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫(kù)搜索提高了可重復(fù)性，將不同設(shè)施之間的一致蛋白質(zhì)鑒定從 1.8% 提高到 35.3%，并強(qiáng)調(diào)了標(biāo)準(zhǔn)集中式方案在 NP 的 PC 分析中用于納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用的重要性。
過(guò)于嚴(yán)格的閾值可能會(huì)遺漏低置信度的肽段，而不太嚴(yán)格的設(shè)置可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。此外，數(shù)據(jù)庫(kù)的限制可能導(dǎo)致對(duì)特征明確的蛋白質(zhì)的偏見，可能會(huì)忽略新的生物標(biāo)志物。由于電離效率和重現(xiàn)性的可變性，無(wú)標(biāo)記定量可能偏向于高豐度蛋白質(zhì)，而標(biāo)記方法（例如，TMT 或細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記 （SILAC））提供了更好的相對(duì)定量，但成本高昂且多重檢測(cè)能力有限。定量方法的選擇會(huì)影響低豐度生物標(biāo)志物的檢測(cè)和差異表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。此外，用于歸一化和縮放數(shù)據(jù)的方法（例如，總離子電流和中位歸一化）會(huì)影響相對(duì)豐度計(jì)算，這可能會(huì)偏向于某些蛋白質(zhì)/肽或樣品類型，從而使生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生偏差。換句話說(shuō)，不適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)化可能會(huì)放大技術(shù)差異或掩蓋生物學(xué)相關(guān)的變化。此外，統(tǒng)計(jì)閾值和分析方法用于確定蛋白質(zhì)水平的顯著變化會(huì)影響哪些蛋白質(zhì)/肽被標(biāo)記為潛在的生物標(biāo)志物。事實(shí)上，過(guò)于傳統(tǒng)的閾值可能會(huì)錯(cuò)過(guò)微小但重要的生物變化，而靈活的設(shè)置可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性和不準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物譜。此外，用于解釋數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)工具在生物標(biāo)志物選擇中起著至關(guān)重要的作用。一些工具是針對(duì)特定的蛋白質(zhì)家族或通路量身定制的，這可能導(dǎo)致偏向于某些生物過(guò)程，可能會(huì)忽略可能作為潛在診斷生物標(biāo)志物的不太明確的蛋白質(zhì)。
展望 – 我們?nèi)绾螐浐?/strong> NPs PC 分析的差距？
為了解決在納米生物界面進(jìn)行 LC-MS/MS 分析過(guò)程中 NP PC 結(jié)果的不一致性和不可重復(fù)性，我們提出了三項(xiàng)關(guān)鍵行動(dòng)，包括：（i） 標(biāo)準(zhǔn)化樣品制備和蛋白質(zhì)消化方案，（ii） 協(xié)調(diào) LC-MS/MS 儀器和工作流程，以及 （iii） 實(shí)施統(tǒng)一的數(shù)據(jù)處理。使用標(biāo)準(zhǔn)作方案，尤其是在各種消化步驟中，對(duì)于可靠和可重復(fù)的 NP 的 PC 結(jié)果至關(guān)重要。通過(guò)統(tǒng)一蛋白質(zhì)濃度測(cè)量技術(shù)（例如，僅 BCA 方法）、一致的方案步驟（包括預(yù)酶解還原和烷基化）、使用一致的添加劑（即化學(xué)品/材料）（如變性劑和還原劑）、酶（例如胰蛋白酶）和酶蛋白比（例如，1：50）、酶解時(shí)間（例如，18 小時(shí)）、溫度（37 °C）等，實(shí)驗(yàn)室可以最大限度地減少肽回收和蛋白質(zhì)鑒定的差異。這種標(biāo)準(zhǔn)化使得在獨(dú)立研究中輕松比較 PC 結(jié)果，并提高蛋白質(zhì)定量和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)工作的準(zhǔn)確性。
在標(biāo)準(zhǔn)化 LC-MS/MS 儀器中，建議使用類似類型的 LC 和 MS 儀器，以減少分析之間的不一致。同步 LC-MS/MS 儀器和設(shè)置（如質(zhì)量分辨率、電離模式、碎裂方法等）也很重要，以確保研究之間的重現(xiàn)性，這對(duì)于更廣泛的納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用至關(guān)重要。在系統(tǒng)式 LC-MS/MS 儀器中，應(yīng)統(tǒng)一設(shè)置不同儀器的質(zhì)量分辨率（例如，在 Orbitrap 系統(tǒng)上為 60,000 或更高），并且電離模式也應(yīng)保持一致（例如，肽分析為陽(yáng)性，磷蛋白為陰性）。應(yīng)根據(jù)樣品類型選擇碎裂方法（即 HCD 或 CID）（例如，用于肽鑒定的 HCD 具有 30–35% 的歸一化碰撞能量）。此外，校準(zhǔn)程序和內(nèi)標(biāo)（例如用濃度為 50 fmol/μL 的重標(biāo)記肽加標(biāo)樣品）有助于對(duì)齊儀器響應(yīng)，確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)中的準(zhǔn)確定量。
在用于 NP PC 分析的統(tǒng)一原始 LC-MS/MS 數(shù)據(jù)處理中，關(guān)鍵考慮因素可能包括標(biāo)準(zhǔn)化峰拾取、降噪和對(duì)齊算法，以確保在相同樣品中對(duì)肽的一致檢測(cè)。應(yīng)用統(tǒng)一的 FDR 閾值（例如 1 %）進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定可減少假陽(yáng)性，而一致的歸一化和定量方法可確保蛋白質(zhì)豐度的可比性。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)（例如，Maxquant 或蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)器）和統(tǒng)一的搜索參數(shù)，例如可變修飾（例如，M 氧化、蛋白質(zhì) N 末端的乙?；?、天冬酰胺的脫酰胺、脲甲基化等）和允許的漏缺切割（例如，最多 2 個(gè)）在很大程度上最大限度地減少了最終結(jié)果的可變性。這些步驟相結(jié)合提高了可重復(fù)性，減少了偏倚，并增強(qiáng)了 NP PC 研究中生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的可靠性。
由于 NP 表面的蛋白質(zhì)持續(xù)吸附和解吸，捕獲 PC 組成的動(dòng)態(tài)變化仍然是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。雖然目前的檢測(cè)方法（如 LC-MS/MS）僅提供蛋白冠的靜態(tài)快照，但研究人員一直在探索實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)，以更好地了解 PC 在 NP 表面上的動(dòng)態(tài)形成。通過(guò)散射顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)光學(xué)納米顆粒分析 （RONAS） 和表面等離子體共振顯微鏡 （SPRM） 等方法能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)吸附和解吸進(jìn)行動(dòng)力學(xué)跟蹤。此外，片上電氣監(jiān)控技術(shù)可實(shí)時(shí)對(duì)軟硬 PC 進(jìn)行無(wú)標(biāo)記觀察。此外，場(chǎng)流分離 （FFF） 已成為 PC 原位分析的寶貴工具。FFF 允許溫和分離 NPs 及其相關(guān)的 PC，而不會(huì)破壞所涉及的復(fù)雜平衡。這些進(jìn)步為蛋白冠動(dòng)力學(xué)提供了有價(jià)值的見解，對(duì)納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)具有重要意義。另一方面，將人工智能 （AI） 整合到 PC 分析中，在克服單一檢測(cè)方法的局限性方面具有巨大潛力。機(jī)器學(xué)習(xí)模型可以通過(guò)預(yù)測(cè) PC 形成、跟蹤動(dòng)態(tài)變化和提高 PC 成分分析的準(zhǔn)確性來(lái)增強(qiáng)實(shí)時(shí)監(jiān)控。來(lái)自質(zhì)譜、SPR 和散射顯微鏡等多種技術(shù)的 AI 驅(qū)動(dòng)數(shù)據(jù)集成可以更全面地了解 PC 動(dòng)力學(xué)。然而，挑戰(zhàn)仍然存在，包括需要高質(zhì)量的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集、分析方法的標(biāo)準(zhǔn)化以及在復(fù)雜生物環(huán)境中驗(yàn)證 AI 預(yù)測(cè)。
總之，雖然質(zhì)譜法對(duì)于在 NP 的 PC 研究中鑒定疾病特異性蛋白質(zhì)非常有價(jià)值，但必須仔細(xì)注意方法學(xué)陷阱，因?yàn)樗赡軙?huì)引入方法學(xué)不一致的重大風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的錯(cuò)誤行為。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化方案、儀器和嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理來(lái)應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，將提高基于 MS 的 PC 分析的可靠性，并在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究中提供更準(zhǔn)確和可重現(xiàn)的結(jié)果。廈門普睿邁格生物科技有限公司提供低豐度蛋白富集磁珠http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/8096211554.html
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