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Differences in Protein Capture by SP3 and SP4 Demonstrate Mechanistic Insights of Proteomics Cleanup Techniques, 
Jessica M. Conforti, Amanda M. Ziegler, Charli S. Worth, Adhwaitha M. Nambiar, Jacob T. Bailey, Joseph H. Taube, and Elyssia S. Gallagher
Journal of Proteome Research 2024 23 (9), 3877-3889
DOI: 10.1021/acs.jproteome.4c00206

摘要：蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是鑒定蛋白質(zhì)以觀察細(xì)胞過程和疾病的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)挑戰(zhàn)是蛋白質(zhì)提取后去除污染物，這可能會(huì)限制蛋白質(zhì)鑒定。SP3增強(qiáng)樣品制備是一種凈化技術(shù)，其中蛋白質(zhì)通過親水相互作用液相色譜 （HILIC） 類似機(jī)制捕獲在羧基修飾的顆粒上。最近的結(jié)果表明，由于蛋白質(zhì)聚集機(jī)制，蛋白質(zhì)被捕獲在 SP3 中。SP4是一種新的凈化技術(shù)，它采用蛋白質(zhì)沉淀聚集來捕獲蛋白質(zhì)，而無需修飾顆粒。我們假設(shè) SP3 和 SP4 捕獲機(jī)制的差異會(huì)影響每種凈化技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)。在此，我們?cè)u(píng)估了使用 SP3 與 SP4 鑒定和富集的 MCF7 亞細(xì)胞組分的蛋白質(zhì)，并將每種方法中的蛋白質(zhì)捕獲與蛋白質(zhì)疏水性相關(guān)聯(lián)。我們的結(jié)果表明，SP3 通過 類HILIC和蛋白質(zhì)聚集機(jī)制的組合捕獲更多的親水性蛋白質(zhì)，而 SP4 通過蛋白質(zhì)聚集機(jī)制捕獲更多的疏水性蛋白質(zhì)。最終，我們證明了蛋白質(zhì)捕獲機(jī)制是不同的，并且選擇產(chǎn)生高蛋白質(zhì)組覆蓋率的純化技術(shù)取決于蛋白質(zhì)-樣品的疏水性。SP3磁珠請(qǐng)參考http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/1736805216.html。

介紹

蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)關(guān)鍵目標(biāo)是鑒定生物樣品中的蛋白質(zhì)，以揭示調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的疾病生物標(biāo)志物和翻譯后修飾。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)需要檢測(cè)和鑒定具有不同特性且以不同濃度存在于生物樣品中的蛋白質(zhì)。通常，蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程包括蛋白質(zhì)提取、二硫鍵還原、游離半胱氨酸烷基化、樣品凈化、蛋白質(zhì)消化、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 （LC-MS/MS） 和數(shù)據(jù)庫搜索。在蛋白質(zhì)提取過程中，緩沖液、鹽和離液劑等污染物會(huì)破壞細(xì)胞膜以釋放和溶解蛋白質(zhì)，同時(shí)保持生理 pH 值以避免蛋白質(zhì)沉淀。雖然這些污染物對(duì)于蛋白質(zhì)提取是必需的，但在電噴霧過程中會(huì)抑制消化酶活性、LC 分離度和肽電離，從而減少鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)量。

盡管在蛋白質(zhì)消解之前必須有效去除蛋白質(zhì)提取產(chǎn)生的污染物，但樣品凈化仍然是蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程中的一個(gè)限制。SP3是一種凈化技術(shù)，與基于過濾器的方法相比，能夠鑒定更多的肽和蛋白質(zhì)，具有更高的試驗(yàn)間重現(xiàn)性。SP3 使用有機(jī)變性溶劑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與羧基磁珠結(jié)合。引入該技術(shù)后，有人提出蛋白質(zhì)基于類親水相互作用液相色譜 （HILIC）機(jī)制與顆粒相互作用。使用外部磁鐵，將蛋白質(zhì)結(jié)合的顆粒吸引到微量離心管的側(cè)面，從而在蛋白質(zhì)消化之前去除上清液中的污染物。然而，羧基磁珠可以 （1） 不充分結(jié)合蛋白質(zhì)，導(dǎo)致殘留在上清液中的蛋白質(zhì)丟失;（2） 通過與蛋白酶抑制劑結(jié)合來破壞消化效率;（3） 不可逆地結(jié)合蛋白質(zhì)，防止它們被帶入 LC-MS/MS; （4） 如果攜帶到儀器中，會(huì)堵塞 LC 色譜柱。

SP3 的蛋白質(zhì)捕獲機(jī)制最近受到挑戰(zhàn)，表明 SP3 主要通過蛋白質(zhì)聚集機(jī)制捕獲蛋白質(zhì)，而不是 HILIC 樣機(jī)制。SP4采用提出的這種蛋白質(zhì)聚集機(jī)制，省略了磁性羧酸鹽修飾的顆粒。在 SP4 中，使用有機(jī)溶劑沉淀和聚集蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)能夠通過離心沉淀。有問題的污染物留在上清液中去除，產(chǎn)生用于消化的聚集蛋白沉淀。與 SP3 相比，SP4 以前能夠鑒定 HEK293、Jurkat 人永生化 T 和 E14 小鼠胚胎干細(xì)胞裂解物的相似或更多數(shù)量的肽和蛋白質(zhì)。對(duì)于 HEK293 裂解物，與 SP3 相比，SP4 還富集了低溶解度跨膜蛋白的回收率。 蛋白質(zhì)捕獲的這種差異可能是由于 SP3 中使用的羧酸鹽修飾顆粒。因此，我們假設(shè) SP3 和 SP4 具有不同的蛋白質(zhì)捕獲機(jī)制，影響使用每種樣品純化技術(shù)時(shí)鑒定和富集的蛋白質(zhì)。

在這項(xiàng)工作中，我們旨在比較 SP3 和 SP4 鑒定和富集的蛋白質(zhì)類型。此外，我們評(píng)估了脫氧膽酸鈉 （SDC） 輔助消化的能力，以對(duì)抗 SP4 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀的不溶性，并增加 SP3 和 SP4 中疏水蛋白質(zhì)的檢測(cè)。在本文中，我們比較了用 SP3、SP4、SP3（去污劑輔助 （DA））和 SP4（去污劑輔助 （DA））制備的樣品的鑒定蛋白質(zhì)。具體來說，我們使用密歇根癌癥基金會(huì) 7 （MCF7） 乳腺癌亞細(xì)胞組分（包括細(xì)胞質(zhì)、膜、可溶核、染色質(zhì)結(jié)合核和細(xì)胞骨架組分）進(jìn)行深度蛋白質(zhì)組分析。亞細(xì)胞組分包含具有不同特性的蛋白質(zhì)，并用作分級(jí)分離的一種形式，降低了全細(xì)胞裂解物的復(fù)雜性，并能夠檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)。最終，我們的結(jié)果顯示每種清理技術(shù)鑒定和富集的蛋白質(zhì)存在差異，我們與蛋白質(zhì)捕獲機(jī)制的差異相關(guān)聯(lián)。

實(shí)驗(yàn)程序

材料

碳酸氫銨來自 Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）。Emplura 無水乙醇和高純度脫氧膽酸鈉 （99%） 來自 VWR International （Radnor， PA）。胰蛋白酶/Lys-C 混合物（質(zhì)譜級(jí)）來自 Promega（威斯康星州麥迪遜）。Glu-1-纖維蛋白肽 B 來自 Waters（馬薩諸塞州米爾福德）。所有其他物品均購自 ThermoFisher Scientific（馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。納米純水來自 Purelab Flex 3 純水系統(tǒng)（Elga，Veolia Environment S.A.，法國(guó)巴黎）。

細(xì)胞培養(yǎng)和裂解

MCF7 乳腺癌細(xì)胞（ATCC HTB-22，弗吉尼亞州馬納薩斯）在補(bǔ)充有 10% 胎牛血清（Gibco，Billings，MT）和 1% 青霉素/鏈霉素 （Gibco） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基（Corning，Corning，NY）中培養(yǎng)。使用 PlasmoTest TM 支原體檢測(cè)試劑盒（InvivoGen，San Diego，CA）定期檢測(cè)細(xì)胞是否受到支原體污染，并在 80% 匯合時(shí)傳代。

使用含有 0.025 M Tris、0.15 M NaCl、0.001 M EDTA、1% NP-40 和 5% 甘油的裂解緩沖液（Pierce 免疫共沉淀試劑盒，ThermoFisher Scientific）收獲全細(xì)胞蛋白。使用培養(yǎng)細(xì)胞亞細(xì)胞蛋白分級(jí)分離試劑盒 （ThermoFisher Scientific） 對(duì) 1.0 × 10⁷ 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞蛋白分級(jí)分離。使用二辛可寧酸 （BCA） 測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過使用每個(gè)亞細(xì)胞組分的已建立蛋白質(zhì)標(biāo)志物進(jìn)行免疫印跡來確認(rèn)亞細(xì)胞組分分離。

還原和烷基化

將蛋白質(zhì)樣品加入低結(jié)合力的 1.5 mL 微量離心管中，并在 Reacti-Therm 單模塊加熱模塊 （ThermoFisher Scientific） 上在 100 °C 下使蛋白質(zhì)變性 5 分鐘。在室溫下，將二硫蘇糖醇 （DTT） 添加到蛋白質(zhì)樣品中（蛋白質(zhì)與 DTT 摩爾比為 1：10），并將樣品在 60 °C 和 1,000 rpm 下在 Eppendorf ThermoMixer 溫度控制裝置（Eppendorf，Hamburg，Germany）上孵育 30 分鐘。然后加入碘乙酰胺 （IAA）（蛋白質(zhì)與 IAA 摩爾比為 1：100），并將樣品在室溫下避光孵育 30 分鐘，以使游離半掛烴烷基化。用額外的 DTT（5：1 DTT 與 IAA 摩爾比）淬滅烷基化反應(yīng)。

SP3增強(qiáng)樣品制備

SP3磁珠請(qǐng)參考http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/1736805216.html。Speedbead磁性羧酸鹽改性顆粒（GE45152105050250 和 GE65152105050250，GE Healthcare，芝加哥，伊利諾伊州）以 1：1 （v/v） 的比例合并，用水洗滌 3 次，并以終濃度 50 mg/mL 重懸于水中。將制備的顆粒以 10：1 （w/w） 的顆粒與蛋白質(zhì)比例添加到蛋白質(zhì)樣品中，并以 4：1 （v/v） 的乙腈與蛋白質(zhì)比例加入冷卻的乙腈 （4 °C） 以誘導(dǎo)與顆粒結(jié)合。將蛋白質(zhì)樣品在 ThermoMixer 上于 24 °C 和 1000 rpm 孵育 5 分鐘以增強(qiáng)顆粒-蛋白質(zhì)結(jié)合，然后在室溫下置于 1 T 定制磁架上 5 分鐘。將帶有結(jié)合蛋白的磁性顆粒拉到微量離心管的一側(cè)，并將上清液中的污染物作為廢液去除。用 80% 乙醇水溶液 （v/v） 洗滌蛋白質(zhì)-顆?；旌衔?，置于磁力架上 5 min，含污染物的上清液作為廢液除去。

SP4增強(qiáng)樣品制備

以 4：1 （v/v） 的乙腈與蛋白質(zhì)比例加入冷凍乙腈 （4 °C），以溶解和聚集蛋白質(zhì)。將樣品渦旋混合 （<500 rpm） 5 秒，然后以 16,000g 離心 10 分鐘，以使用 Fisherbrand accuSpin Micro 17 微量離心機(jī) （ThermoFisher Scientific） 沉淀蛋白質(zhì)。除去含污染物的上清液作為廢液，用 80% 乙醇水溶液 （v/v） 洗滌蛋白沉淀，以 16,000g 離心 10 min，含異物的上清液作為廢液除去。

標(biāo)準(zhǔn)消解

胰蛋白酶/賴氨酸-C 以 1：50 （w/w） 的酶蛋白比例加入 100 mM 碳酸氫銨，pH 值為 8。將蛋白質(zhì)在 ThermoMixer 上于 37 °C 和 1000 rpm 消化 18 小時(shí)。然后將肽樣品置于磁力架 （SP3） 上或以 16,000g （SP4） 離心 10 分鐘，并將含肽的上清液移至干凈的樣品瓶中。

SP3 （DA） 和 SP4 （DA）去污劑輔助消化

胰蛋白酶/賴氨酸-C 以 1：50 （w/w） 的酶蛋白比例加入 100 mM 碳酸氫銨 （pH 8） 和 1% SDC（使用 10% SDC （w/v） 儲(chǔ)備液）。蛋白質(zhì)在 ThermoMixer 上以 37 °C 和 1,000 rpm 消化 18 小時(shí)。將乙腈加入 20% （v/v） 的最終溶劑混合物中以提高疏水肽回收率，并將三氟乙酸 （TFA） 加入至 0.5% 以沉淀 SDC 并淬滅消化。將肽樣品以 16,000g 離心 10 分鐘，以沉淀去污劑和任何不溶性碎片。對(duì)于 SP3 （DA），然后將樣品放在磁力架上 5 分鐘，以確保顆粒不會(huì)被帶入儀器。然后將 SP3 （DA） 和 SP4 （DA） 樣品的肽上清液移至干凈的樣品瓶中?？偨Y(jié)了所有四種樣品清理技術(shù)。SP3磁珠請(qǐng)參考http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/1736805216.html。

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)

根據(jù) Thermo Scientific Nanodrop One 的測(cè)量結(jié)果，將肽用 99% 水、0.9% 乙腈和 0.1% 甲酸稀釋至濃度約為 ～0.5 μg/μL。將肽（2 μL）進(jìn)樣到配備Waters ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18捕集柱（5 μm， 180 μm × 20 mm）的Waters nanoACQUITY UPLC色譜柱上，與Waters ACQUITY UPLC PST BEH C18 nanoACQUITY分析柱（1.7 μm、75 μm×100 mm）聯(lián)用。在 MS 分析之前，使用由溶劑 A（99.9% 水和 0.1% 甲酸）和溶劑 B（99.9% 乙腈和 0.1% 甲酸）組成的梯度來分離肽。完整的 LC 梯度如表 S2 所示。

使用Fossilion Sharp Singularity LOTUS nESI發(fā)射器（Fossiliontech，西班牙馬德里），通過Waters Z-Spray NanoLockspray電離源，將從液相色譜柱洗脫的肽噴入Waters Synapt G2-S高分辨率質(zhì)譜儀中。使用 Glu-1-纖維蛋白肽 B 作為參考鎖定質(zhì)量，精確 m/z 為 785.8421，用于質(zhì)量校準(zhǔn)和采集后質(zhì)量校正。在正離子分辨率模式下，以下串聯(lián) MS 參數(shù)用于數(shù)據(jù)非依賴性分析：質(zhì)量分辨率：20,000，掃描范圍：50–2000 m/z，超清晰 MS^E （UDMS^E） 的傳遞碰撞能量斜坡：歌渦分箱 0–20，保持 17 eV;移動(dòng)性箱 20-110，將碰撞能量從 17 eV 增加到 45 eV;移動(dòng)性 bin 110–200，將碰撞能量從 45 eV 增加到 60 eV。優(yōu)化的 MS 參數(shù)如圖 S6 和表 S3 所示。

數(shù)據(jù)庫搜索

用于蛋白質(zhì)組學(xué)的 Progenesis QI（4.2 版，非線性動(dòng)力學(xué)，沃特世公司）用于搜索含有 80,027 種蛋白質(zhì)（經(jīng)典蛋白和亞型，2022 年 6 月下載）的 Uniprot Homo Sapien 參考蛋白質(zhì)組 （UP000005640） 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。為了確定僅用一種方法鑒定的肽和蛋白質(zhì)的數(shù)量，我們檢索了來自單一純化技術(shù)的數(shù)據(jù)。而成對(duì)比較 （SP3 與 SP4、SP3 與 SP3 （DA） 和 SP4 與 SP4 （DA）） 通過每種方法進(jìn)行火山圖、水腫總平均數(shù) （GRAVY） 和基因本體論 （GO）-Slim 分析，以確定富集的蛋白質(zhì)。導(dǎo)入數(shù)據(jù)，校正 Glu-1-纖維蛋白肽 B 鎖質(zhì)量數(shù)，并啟用離子計(jì)數(shù)工作流程，以使用 UDMS^E 鑒定肽。使用以下搜索參數(shù)：肽和片段容差：自動(dòng)，酶特異性：賴氨酸和精氨酸 C 端裂解 （/K-\P/R-\P），最大離子電荷：20，漏缺切割：最多 2，運(yùn)行對(duì)齊：自動(dòng)，峰挑選靈敏度：自動(dòng)，最大蛋白質(zhì)質(zhì)量：250 kDa，離子匹配要求：5 個(gè)片段/蛋白質(zhì)、2 個(gè)片段/肽和 1 個(gè)肽/蛋白質(zhì)。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率設(shè)定為 <1%，iadbs.exe Progenesis Qi 用于蛋白質(zhì)組學(xué)，“動(dòng)態(tài)”創(chuàng)建隨機(jī)序列。修飾包括半胱氨酸的固定脲甲基化、蛋氨酸的可變氧化以及絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的可變磷酸化。磷酸化被包括在內(nèi)，因?yàn)檫@種常見的修飾對(duì)細(xì)胞功能至關(guān)重要，并且在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中特別發(fā)現(xiàn)。使用 Hi-3 和蛋白質(zhì)分組完成相對(duì)定量的自動(dòng)處理，以生成原始和歸一化的蛋白質(zhì)豐度、最大倍數(shù)變化和方差分析值。所有 LC-MS/MS 原始數(shù)據(jù)均已存入 MassIVE 和 ProteomeXchange 存儲(chǔ)庫，并帶有以下入藏號(hào)：（MSV000094130） 和 （PXD049965）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)

對(duì)于每個(gè)生物樣品（全細(xì)胞裂解物、細(xì)胞質(zhì)、膜、可溶核、染色質(zhì)結(jié)合核和細(xì)胞骨架組分），為每種凈化技術(shù)（SP3、SP4、SP3（DA） 和 SP4（DA））制備三個(gè)樣品制備重復(fù)，共 72 個(gè)樣品。每個(gè)樣品完成 3 次技術(shù)儀器重復(fù)，共計(jì) 216 次儀器運(yùn)行。除非另有說明，否則所有表格、圖表和條形圖都使用 Microsoft Excel（版本 2301）。成對(duì)比較的統(tǒng)計(jì)顯著性由雙尾 F 檢驗(yàn)和 t 檢驗(yàn)確定。在 Excel 中按描述手動(dòng)搜索鑒定出的蛋白質(zhì)組，以確定它們是否在一種或多種樣品純化技術(shù)中被鑒定出來。UpSet 圖用于可視化蛋白質(zhì)組交叉，并使用 UpSetR 包在 R 中構(gòu)建。DAVID 功能注釋工具 （2021 版，2023 年 2 月訪問）用于將蛋白質(zhì)組 中的先導(dǎo)蛋白鑒定映射到細(xì)胞成分。將 DAVID 輸出的細(xì)胞成分手動(dòng)分為以下幾類：細(xì)胞質(zhì)、膜、細(xì)胞核、細(xì)胞骨架或非特異性成分。非特異性細(xì)胞組分包括無法有效歸類為其他類別的一般注釋，包括“細(xì)胞”、“細(xì)胞部分”、“細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器”等。圖 S7 和 S8 描述了 DAVID 輸入?yún)?shù)以及 DAVID 的所有細(xì)胞組分輸出，以及它們?nèi)绾伪环纸M到類別中。然后構(gòu)建餅圖，顯示映射到每個(gè)細(xì)胞類別的已鑒定蛋白質(zhì)的百分比。在 Excel 中使用 Progenesis 的最大倍數(shù)變化和 P 值 （ANOVA） 輸出構(gòu)建火山圖，以觀察每種樣品凈化技術(shù)富集的蛋白質(zhì)組。使用 GRAVY 計(jì)算器 （https://www.gravy-calculator.de/index.php） 完成 GRAVY 分析，對(duì)火山圖中富集的蛋白質(zhì)組進(jìn)行鉛蛋白鑒定 。PANTHER （版本 17.0,2023 年 2 月訪問）用于對(duì) Progenesis 中富集的蛋白質(zhì)組進(jìn)行 GO-Slim 細(xì)胞成分分析。所有 PANTHER 輸入?yún)?shù)如圖 S9 所示。

結(jié)果與討論

根據(jù)亞細(xì)胞組分的不同，在不同的樣品純化技術(shù)中觀察到肽和蛋白質(zhì)組鑒定的增加

我們首先比較了 MCF7 細(xì)胞裂解物的每種純化方法中鑒定出的肽和蛋白質(zhì)組的數(shù)量。與以前的研究一致，在比較所有四種純化技術(shù)時(shí)，SP4 能夠鑒定出全細(xì)胞裂解物中數(shù)量最多的肽和蛋白質(zhì)組（圖 1）。與過去的參考文獻(xiàn)相比， 全細(xì)胞裂解物樣品的蛋白質(zhì)鑒定似乎較少。這可能是由于用于測(cè)定樣品濃度的 Nanodrop 測(cè)量存在不確定性，因此向 LC-MS/MS 中進(jìn)樣的樣品量較少。然而，我們預(yù)計(jì)影響蛋白質(zhì)鑒定的最重要因素是在工作中使用飛行時(shí)間 （TOF） 質(zhì)量分析儀。眾所周知，全細(xì)胞裂解物樣品的復(fù)雜性會(huì)導(dǎo)致 TOF 質(zhì)量分析器的鑒定計(jì)數(shù)降低，即使優(yōu)化了離子淌度（圖 S6）和 Tune 頁面參數(shù)（表 S3），這是由于低豐度蛋白質(zhì)的掩蓋、光譜復(fù)雜性增加和肽電離效率的差異。本研究中使用了 TOF 質(zhì)量分析器，因?yàn)樗軌蛲ㄟ^數(shù)據(jù)非依賴性采集來采集數(shù)據(jù)，并通過數(shù)據(jù)依賴性采集分析樣品中的所有離子與選定的離子。為了增加蛋白質(zhì)組覆蓋率以對(duì) MCF7 乳腺癌細(xì)胞中的低豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行深度分析，使用了亞細(xì)胞組分離?？傮w而言，SP3、SP4、SP3（DA） 和 SP4（DA） 在所有亞細(xì)胞組分中分別鑒定出 3451、3517、3070 和 3094 個(gè)獨(dú)特蛋白組。與之前的研究一致，當(dāng)從組合的亞細(xì)胞組分中匯集鑒定出的蛋白質(zhì)組時(shí)，我們看到鑒定結(jié)果增加。

圖 1.使用 SP3、SP4、SP3（去污劑輔助 （DA））和 SP4（去污劑輔助 （DA））對(duì) MCF7 乳腺癌全細(xì)胞裂解物和亞細(xì)胞組分的鑒定肽 （A） 和蛋白組 （B） 的平均數(shù)量進(jìn)行比較。樣本由虛線分隔，圖頂部帶有標(biāo)簽。誤差線表示均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。條形圖上方的括號(hào)線顯示成對(duì)比較的顯著性，用 *p < 0.05、**p < 0.01 和 ***p < 0.001 表示。沒有 * 表示法的比較沒有顯著差異，并且處于測(cè)量不確定度范圍內(nèi)。

預(yù)計(jì)亞細(xì)胞組分具有較高的親水性或疏水性蛋白質(zhì)的普遍性;因此，亞細(xì)胞組分用于評(píng)估蛋白質(zhì)捕獲機(jī)制的差異。首先評(píng)估膜組分的鑒定肽和蛋白質(zhì)組的數(shù)量。與所有方法相比，SP4 鑒定出膜組分中數(shù)量最多的肽和蛋白質(zhì)組，其中包括包含疏水結(jié)構(gòu)域的膜蛋白（圖 1）。

然后比較已鑒定的肽和蛋白質(zhì)組的數(shù)量，以查找預(yù)期含有親水性蛋白質(zhì)的組分，包括細(xì)胞質(zhì)、可溶性核、染色質(zhì)結(jié)合核和細(xì)胞骨架組分。對(duì)于細(xì)胞質(zhì)組分，SP3 和 SP4 產(chǎn)生最多的已鑒定蛋白組，而 SP4 產(chǎn)生最多的肽（圖 1）。對(duì)于可溶性核和染色質(zhì)結(jié)合的核組分，SP3 提供了最多的肽和蛋白質(zhì)組鑒定。最后，對(duì)于細(xì)胞骨架部分，SP3 產(chǎn)生最多的鑒定肽，而 SP3 和 SP4 都鑒定出大量蛋白質(zhì)組。當(dāng)考慮到親水性蛋白（如肌動(dòng)蛋白絲和微管）和疏水蛋白（包括中間絲，如角蛋白、波形蛋白和神經(jīng)絲）都存在于該組分中時(shí)，預(yù)計(jì) SP3 和 SP4 鑒定的蛋白質(zhì)組的數(shù)量相似。以前，與 SP4 相比，SP3 在細(xì)胞裂解物中產(chǎn)生的鑒定肽和蛋白質(zhì)數(shù)量較少。然而，此處介紹的結(jié)果表明，SP3 是一種有效的凈化技術(shù)，用于識(shí)別某些亞細(xì)胞組分中相似或更高數(shù)量的蛋白質(zhì)組，特別是那些預(yù)計(jì)含有高豐度親水性蛋白質(zhì)的組分。

在評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)品與去污劑輔助消化時(shí)，除了使用 SP3 與 SP3 （DA） 的全細(xì)胞裂解物進(jìn)行比較外，SDC 輔助消化沒有產(chǎn)生最高數(shù)量的鑒定肽和蛋白質(zhì)組鑒定（圖 1）。預(yù)計(jì) SDC 不會(huì)對(duì)肽和蛋白質(zhì)組鑒定產(chǎn)生負(fù)面影響，因?yàn)樗窃?span> LC-MS/MS 之前沉淀的（圖 S3）。然而，先前的報(bào)道表明，一些肽在消化后的酸化過程中會(huì)與 SDC 沉淀，從而減少檢測(cè)到的肽的總數(shù)。

不同的樣品凈化技術(shù)可識(shí)別不同類型的蛋白質(zhì)

接下來，我們比較了使用注釋細(xì)胞成分的每種清理技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)類型。根據(jù)它們是使用一種、兩種、三種還是所有四種純化技術(shù)鑒定，對(duì)所有鑒定的蛋白質(zhì)組進(jìn)行排序（圖 2）。評(píng)估通過所有純化技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)，通過所有四種方法分別鑒定出全細(xì)胞裂解物、細(xì)胞質(zhì)、膜、可溶核、染色質(zhì)結(jié)合核和細(xì)胞骨架組分的 484、515、572、330、199 和 50 種蛋白質(zhì)（圖 2）。然后通過 DAVID 功能注釋工具將所有純化技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)組的先導(dǎo)蛋白鑒定映射到細(xì)胞成分類別。當(dāng)評(píng)估通過所有四種方法在每個(gè)組分中鑒定的蛋白質(zhì)時(shí)，觀察到與每個(gè)細(xì)胞成分相關(guān)的鑒定蛋白質(zhì)增加，表明亞細(xì)胞分級(jí)分離是成功的（圖 S10）。然而，對(duì)于所有樣品和亞細(xì)胞組分，使用所有四種純化技術(shù)鑒定出不到 20% 的檢測(cè)到的蛋白質(zhì)組，這表明基于純化技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)組存在明顯差異。

圖 2.使用 SP3、SP4、SP3（DA） 和 SP4（DA） 對(duì)全細(xì)胞裂解物 （A）、細(xì)胞質(zhì) （B）、膜 （C）、可溶性核 （D）、染色質(zhì)結(jié)合核 （E） 和細(xì)胞骨架 （F） 組分的已鑒定蛋白組數(shù)的異常圖。組大小表示每種方法的已鑒定蛋白質(zhì)組的總數(shù)。條形圖顯示了用 1 種、2 種、3 種或全部4種方法鑒定蛋白質(zhì)組的頻率，如條形圖下方的黑色實(shí)線圓圈所示。

然后，我們專注于比較僅使用一種純化技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)。首先評(píng)估全細(xì)胞裂解物和膜組分，預(yù)計(jì)它們含有疏水蛋白。我們的結(jié)果表明，與這兩個(gè)樣品的其他純化技術(shù)相比，僅通過 SP4 鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量更多（圖 2）。與所有純化技術(shù)相比，SP4 （DA） 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在全細(xì)胞裂解物中映射到最高百分比的膜細(xì)胞成分 （40%） （圖 3Aiv），而 SP4 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在膜部分中映射到最高百分比的膜細(xì)胞成分 （41.5%） （圖 3Cii）。這些結(jié)果表明，對(duì)于預(yù)期含有疏水性蛋白質(zhì)的樣品，與 SP3 和 SP3（DA） 相比，僅通過 SP4 和 SP4（DA） 鑒定的膜蛋白更多。

圖 3.每個(gè)樣品僅通過一種純化技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)組的細(xì)胞組分類別（列：SP3 （i）、SP4 （ii）、SP3（DA） （iii）、SP4（DA） （iv））（行：全細(xì)胞裂解物 （A）、細(xì)胞質(zhì) （B）、膜 （C）、可溶性核 （D）、染色質(zhì)結(jié)合核 （E） 和細(xì)胞骨架 （F） 級(jí)分）。通過 DAVID 功能注釋工具將僅由一種純化技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)組 （n） 映射到細(xì)胞組分，并手動(dòng)分組為細(xì)胞組分類別：細(xì)胞質(zhì)（純綠色）、膜（純藍(lán)色）、細(xì)胞核（方格黃色）、細(xì)胞骨架（純紅色）或非特異性（條紋灰色）。缺失餅圖表示使用指定方法在該亞細(xì)胞組分中唯一鑒定的蛋白質(zhì)沒有顯著的功能注釋。類別百分比的計(jì)算方法是將類別中映射的細(xì)胞成分的數(shù)量除以映射細(xì)胞成分的總數(shù)。

對(duì)于含有親水性蛋白質(zhì)（細(xì)胞質(zhì)、可溶性核、染色質(zhì)結(jié)合核和細(xì)胞骨架組分）的組分，還評(píng)估了僅用一種純化技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)、染色質(zhì)結(jié)合的核和細(xì)胞骨架組分中，與其他純化技術(shù)相比，僅由 SP3 鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量更多（圖 2）。對(duì)于細(xì)胞質(zhì)組分，SP3 （DA） 產(chǎn)生最高百分比的映射到細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞成分的蛋白質(zhì) （10.5%）（圖 3Biii）。對(duì)于可溶性核和染色質(zhì)結(jié)合的核級(jí)分，SP3 產(chǎn)生的映射到核細(xì)胞成分的蛋白質(zhì)百分比最高（分別為 17.3% 和 26.7%）（圖 3Di，Ei）。這些結(jié)果表明，對(duì)于含有親水性蛋白的樣品，與 SP4 和 SP4（DA） 相比，僅用 SP3 和 SP3（DA） 鑒定的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白更多。

成對(duì)比較可確認(rèn)富集蛋白的差異

到目前為止，我們已經(jīng)比較了使用每種純化技術(shù)檢測(cè)到的蛋白質(zhì)組的數(shù)量和身份的差異。然而，比較通過兩種方法捕獲但觀察到具有顯著豐度差異的蛋白質(zhì)組也很重要，我們將其稱為富集差異。為了評(píng)估富集的蛋白質(zhì)組，使用成對(duì)比較 （SP3 與 SP4、SP3 與 SP3 （DA） 和 SP4 與 SP4 （DA）） 生成火山圖。

首先比較 SP3 與 SP4 樣品純化技術(shù)，以確定每種方法富集的蛋白質(zhì)組數(shù)。在評(píng)估含有疏水性蛋白的全細(xì)胞裂解物和膜組分時(shí)，與 SP3 相比，SP4 從全細(xì)胞裂解物（圖 4Ai）和膜組分（圖 4Ci）中富集了更多的蛋白質(zhì)組。雖然富集的蛋白質(zhì)數(shù)量?jī)H占總鑒定結(jié)果的一小部分（圖 1），但 SP3 或 SP4 富集的蛋白質(zhì)百分比與之前對(duì)全細(xì)胞裂解物的研究一致。此外，這些結(jié)果與以前的研究一致，這些研究表明，與 SP3 相比，SP4 在全細(xì)胞裂解物中富集了更多的蛋白質(zhì)。

圖 4.Volcano 圖比較了全細(xì)胞裂解物 （A）、細(xì)胞質(zhì) （B）、膜 （C）、可溶性核 （D）、染色質(zhì)結(jié)合核 （E） 和細(xì)胞骨架 （F） 組中 SP3 與 SP4 （DA） 之間富集蛋白組的數(shù)量 SP4 與 SP4 （DA） （ii） 以及 SP4 與 SP4 （DA） 之間的富集蛋白組數(shù)。比較中每種方法的富集蛋白質(zhì)組數(shù)（最大倍數(shù)變化> 2，P 值< 0.05）顯示在每個(gè)面板的頂部。突出顯示的面板表示在每次成對(duì)比較中產(chǎn)生最高富集蛋白組數(shù)的方法。

比較 SP3 與 SP4 對(duì)于預(yù)期含有親水性蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞級(jí)分，SP3 在染色質(zhì)結(jié)合的核（圖 4Ei）和細(xì)胞骨架級(jí)分（圖 4Fi）中富集了更多的蛋白質(zhì)組。與由 SP4 富集的 0 個(gè)蛋白組相比，SP3 還富集了更多的可溶性核組分蛋白組（圖 4Di）。對(duì)于細(xì)胞質(zhì)部分，與 SP3 相比，SP4 富集了更多的蛋白質(zhì)組（圖 4Bi）。然而，有許多蛋白質(zhì)組同時(shí)被 SP3（147 個(gè)蛋白質(zhì)組）和 SP4（181 個(gè)蛋白質(zhì)組）富集（圖 4Bi），表明 SP3 和 SP4 富集了細(xì)胞質(zhì)組分中的不同蛋白質(zhì)。因此，與 SP4 相比，SP3 豐富了細(xì)胞核和細(xì)胞骨架組分中更多蛋白質(zhì)基團(tuán)的鑒定。

還比較了標(biāo)準(zhǔn)酶解與去污劑輔助消化的富集蛋白組數(shù)。雖然去污劑輔助消化不會(huì)產(chǎn)生最多的肽和蛋白質(zhì)組鑒定（圖 1），但與 SP3 相比，SP3（DA） 在全細(xì)胞裂解物（圖 4Aii）和膜（圖 4Cii）組分中富集了更多的蛋白質(zhì)組，而與全細(xì)胞裂解物中的 SP4 相比，SP4（DA） 富集了更多的蛋白質(zhì)組（圖 4Aiii）。此外，在預(yù)期含有更多親水性蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞級(jí)分中，與去污劑輔助消化相比，標(biāo)準(zhǔn)消化富集了更多的蛋白質(zhì)組（圖 4Bii、Dii、Eii、Fii、Biii、Diii、Eiii、Fiii）。這些結(jié)果表明，對(duì)于含有親水性蛋白質(zhì)的餾分，與去污劑輔助酶解相比，標(biāo)準(zhǔn)酶解富集了更多的蛋白質(zhì)組。

通過每種純化技術(shù)富集的蛋白質(zhì)都依賴于疏水性

到目前為止，我們的數(shù)據(jù)表明，每種純化技術(shù)捕獲的蛋白質(zhì)都取決于蛋白質(zhì)疏水性。為了確認(rèn) SP3 富集親水性更強(qiáng)的蛋白質(zhì)，而 SP4 富集更疏水性的蛋白質(zhì)，計(jì)算了 GRAVY 評(píng)分，用于從火山圖中富集蛋白組的先導(dǎo)蛋白鑒定（圖 4）。將富集蛋白的 GRAVY 評(píng)分繪制為頻率分布，以比較不同凈化方法之間疏水性的差異。親水性或疏水性更強(qiáng)的蛋白質(zhì)的 GRAVY 評(píng)分分別轉(zhuǎn)移到圖中更負(fù)或更正的區(qū)域。大多數(shù)蛋白質(zhì)包含親水性和疏水性結(jié)構(gòu)域，因此預(yù)計(jì)許多 GRAVY 評(píng)分在 -0.2 到 0.2 之間。在比較 GRAVY 圖時(shí)，這可能導(dǎo)致峰頂點(diǎn)的相似性; 因此，我們專注于比較 GRAVY 曲線中得分超出此范圍的肩部，以檢查每種方法富集的蛋白質(zhì)疏水性的差異。

首先比較了 SP3 與 SP4 在全細(xì)胞裂解物和預(yù)期含有更多疏水蛋白的膜組分中的 GRAVY 曲線。對(duì)于全細(xì)胞裂解物，SP4 的 GRAVY 曲線的峰頂點(diǎn)為 -0.4，SP3 曲線的峰頂點(diǎn)為 -0.5（圖 5Ai）。與 SP4 相比，SP3 在圖的更負(fù)區(qū)域也有一個(gè)肩部，與 SP3 相比，在曲線的正區(qū)域由 SP4 富集的蛋白質(zhì)數(shù)量更多（圖 5Ai）。這些結(jié)果與之前的研究一致，表明與 SP3 相比，SP4 富含的蛋白質(zhì)更具疏水性。在膜部分，SP3 和 SP4 具有相似的峰頂點(diǎn)，但與 SP4 相比，SP3 曲線在 GRAVY 圖的更負(fù)區(qū)域有一個(gè)肩部（圖 5Ci）。因此，對(duì)于全細(xì)胞裂解物和膜組分，SP3 富集了與 SP4 相似或更親水性的蛋白質(zhì)。

圖 5.SP3 與 SP4 （i）、SP3 與 SP3（DA） （ii） 和 SP4 與 SP4（DA） （iii） 的全細(xì)胞裂解物 （A）、細(xì)胞質(zhì) （B）、膜 （C）、可溶核 （D）、染色質(zhì)結(jié)合核 （E） 和細(xì)胞骨架 （F） 級(jí)分中富集蛋白組的鉛蛋白鑒定的總體平均數(shù) （GRAVY） 評(píng)分分布。負(fù) GRAVY 值越多表示親水性蛋白質(zhì)越多，而正值越多表示疏水性蛋白質(zhì)越多。垂直線表示峰頂點(diǎn)，以幫助比較分布。

然后比較 SP3 與 SP4 純化技術(shù)對(duì)預(yù)期含有親水性蛋白質(zhì)的組分。對(duì)于細(xì)胞質(zhì)部分，SP3 峰頂點(diǎn)為 -0.5，SP4 峰頂點(diǎn)為 -0.4。與 SP4 相比，SP3 的 GRAVY 曲線移動(dòng)到圖中更負(fù)的區(qū)域，并且 SP4 曲線在圖的正區(qū)域有一個(gè)肩部，GRAVY 評(píng)分為 0.5（圖 5Bi）。對(duì)于可溶性核級(jí)分，火山圖顯示與 SP3 相比，SP4 沒有富集任何蛋白質(zhì)（圖 4Di），因此沒有在 SP3 和 SP4 之間進(jìn)行 GRAVY 比較（圖 5Di）。對(duì)于染色質(zhì)結(jié)合的核級(jí)分，SP3 峰頂點(diǎn)移至更負(fù)的區(qū)域，并且圖的負(fù)區(qū)和陽性區(qū)都有肩部（圖 5Ei）。然而，陽性區(qū)域的肩部的 GRAVY 評(píng)分在 -0.2 到 0.2 之間，表明 SP3 富集了包含親水性和疏水性結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。對(duì)于細(xì)胞骨架部分，SP3 GRAVY 曲線比 SP4 曲線更多地延伸到陽性區(qū)域，但 SP4 在非常負(fù)區(qū)捕獲一個(gè)蛋白質(zhì)，在非常陽性區(qū)域捕獲一個(gè)蛋白質(zhì)（圖 5Fi）。對(duì)于該部分，與其他細(xì)胞組分相比，富集的蛋白質(zhì)數(shù)量較少，并且數(shù)據(jù)顯示 SP3 和 SP4 富集的蛋白質(zhì)具有親水性和疏水性蛋白質(zhì)的屬性。我們對(duì)預(yù)期含有親水性蛋白質(zhì)的細(xì)胞組分的結(jié)果表明，與 SP4 富集的蛋白質(zhì)相比，SP3 富集的蛋白質(zhì)相似或更親水性。

富集的蛋白質(zhì)是總蛋白質(zhì)組鑒定的一小部分（圖 1）。我們的結(jié)果表明，SP3 富集的蛋白質(zhì)類似于或比 SP4 富集的蛋白質(zhì)更親水性（圖 5）。這與通過單個(gè)樣品凈化技術(shù)捕獲的蛋白質(zhì)差異一致（圖 3），其中我們觀察到與 SP4 相比，SP3 對(duì)親水細(xì)胞成分的蛋白質(zhì)注釋增加。相比之下，SP3 僅在可溶性核和染色質(zhì)結(jié)合的核組分中鑒定出更親水性的核蛋白（圖 3Di，Ei），而全細(xì)胞裂解物和膜性組分中更疏水性的膜蛋白僅通過 SP4 鑒定（圖 3Ai，Ci）。因此，富集蛋白質(zhì)的疏水性差異（圖 5）與 SP3 與 SP4 實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)組鑒定的預(yù)期疏水性差異一致（圖 3）。

還檢查了比較標(biāo)準(zhǔn)和洗滌劑輔助消化的 GRAVY 曲線（圖 5）。對(duì)于含有親水性蛋白質(zhì)的組分（例如細(xì)胞質(zhì)、可溶性核、染色質(zhì)結(jié)合核和細(xì)胞骨架組分），標(biāo)準(zhǔn)消化的 GRAVY 曲線在圖的親水區(qū)域中具有肩部。而對(duì)于含有疏水蛋白的全細(xì)胞裂解物和膜組分，在去污劑輔助消化中觀察到延伸到圖的疏水區(qū)域的肩部。因此，與去污劑輔助消化相比，標(biāo)準(zhǔn)消化增加了對(duì)相似或更親水性蛋白質(zhì)的檢測(cè)，而與標(biāo)準(zhǔn)消化相比，去污劑輔助消化增加了對(duì)更多疏水性蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

以前，我們?cè)u(píng)估了僅通過一種清理技術(shù)鑒定的蛋白質(zhì)的細(xì)胞成分注釋的差異（圖 3）。細(xì)胞成分本體論的分析將富集的蛋白質(zhì)（圖 4）與執(zhí)行分子功能的基因及其在細(xì)胞中的相關(guān)定位聯(lián)系起來。這可以進(jìn)一步了解在成對(duì)比較中差異富集的蛋白質(zhì)組的生物學(xué)意義。GO 分析通過計(jì)算在樣品中觀察到蛋白質(zhì)的概率相對(duì)于在整個(gè)人類蛋白質(zhì)組中觀察到蛋白質(zhì)的概率，將蛋白質(zhì)組映射到細(xì)胞成分本體。

首先通過 PANTHER 將來自全細(xì)胞裂解物和膜組分的火山圖（圖 4）的富集蛋白組映射到細(xì)胞成分本體，以比較 SP3 與 SP4。亞細(xì)胞級(jí)分的其他 GO 分析可在圖 S9 中找到。在全細(xì)胞裂解物中，SP3 富集的蛋白質(zhì)組定位于細(xì)胞質(zhì)、膜、核和細(xì)胞骨架細(xì)胞成分本體，而 SP4 富集的蛋白質(zhì)組定位于膜細(xì)胞成分本體（圖 6）。預(yù)計(jì)全細(xì)胞裂解物包含所有細(xì)胞成分本體;因此，SP4 僅富集映射到膜細(xì)胞成分本體的蛋白質(zhì)組這一事實(shí)進(jìn)一步證實(shí)了 SP4 識(shí)別（圖 1 和 3）和富集（圖 4 和 5）疏水性膜蛋白的能力。同樣，在膜組分中，SP3 富集的蛋白質(zhì)組映射到膜和細(xì)胞骨架細(xì)胞成分本體，而 SP4 富集的蛋白質(zhì)組僅映射到膜細(xì)胞成分本體（圖 6）。這些結(jié)果與 SP3 鑒定（圖 3Di，Ei）和富集（圖 5）的親水性蛋白的增加一致;以及 SP4 在全細(xì)胞裂解物和膜組分中鑒定（圖 3Ai，Ci）和富集（圖 5Ai）的疏水性膜蛋白。這些結(jié)果表明，SP3 富含具有親水性和膜蛋白的映射到細(xì)胞成分本體的蛋白質(zhì)，而僅觀察到 SP4 具有疏水性蛋白富集映射到膜細(xì)胞成分本體的蛋白質(zhì)。

圖 6.SP3 與 SP4 以及標(biāo)準(zhǔn)與去污劑輔助消化的 GO-Slim 細(xì)胞成分本體的比較。條形圖表示一種清理方法與另一種清理方法中與顯著富集的細(xì)胞組分本體相關(guān)的基因數(shù)量。條形顏色表示細(xì)胞成分本體的分組類別：細(xì)胞質(zhì)（純綠色）、膜（純藍(lán)色）、細(xì)胞核（方格黃色）、細(xì)胞骨架（純紅色）或非特異性（條紋灰色）。

還使用 GO-Slim 評(píng)估了由標(biāo)準(zhǔn)消化和洗滌劑輔助消化富含的蛋白質(zhì)組，以對(duì) SP3 與 SP3 （DA） 和 SP4 與 SP4 （DA） 進(jìn)行成對(duì)比較。通過全細(xì)胞裂解物（圖 6）和膜組分（圖 S9）中的標(biāo)準(zhǔn)消化富集的蛋白質(zhì)組映射到細(xì)胞質(zhì)、膜、核和細(xì)胞骨架細(xì)胞成分本體。而由去污劑輔助消化富集的蛋白質(zhì)組僅映射到膜細(xì)胞成分本體（圖 6 和 S9）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)消化相比，去污劑輔助消化提高了檢測(cè)膜蛋白的能力。

SP3 與 SP4 的蛋白質(zhì)捕獲和富集的機(jī)制差異

SP3 最初被提議通過類似 HILIC 的機(jī)制捕獲蛋白質(zhì)，使用兩種類型的親水性、羧酸鹽修飾的顆粒，這些顆粒的表面親水性不同。（11） 然而，最近的一項(xiàng)研究表明，在 SP3 中，蛋白質(zhì)聚集主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)捕獲，而不是 HILIC 樣相互作用驅(qū)動(dòng) SP3 中的蛋白質(zhì)捕獲。如果 SP3 的蛋白質(zhì)捕獲僅依賴于蛋白質(zhì)聚集，我們預(yù)計(jì) SP3 和 SP4 中鑒定的蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生相似的蛋白質(zhì)鑒定，尤其是在檢查樣品復(fù)雜性降低的亞細(xì)胞組分時(shí)。然而，我們的結(jié)果表明，每種方法鑒定的蛋白質(zhì)組存在明顯差異（圖 2），SP3 和 SP4 鑒定的單個(gè)組分中不到 45% 的蛋白質(zhì)組。我們的結(jié)果表明，在全細(xì)胞裂解物和膜組分中，SP4 能夠鑒定和富集與 SP3 鑒定的蛋白質(zhì)相似或更疏水的蛋白質(zhì)。疏水性蛋白質(zhì)含有更多的不溶性氨基酸，這使得蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)聚集機(jī)制中添加有機(jī)溶劑后能夠很好地聚集。這些結(jié)果與之前的工作一致，后者表明與 SP3 相比，SP4 在細(xì)胞裂解物中富集了低溶解度蛋白質(zhì)。

我們的結(jié)果還表明，對(duì)于預(yù)期含有親水性蛋白質(zhì)的組分，SP3 能夠識(shí)別（圖 1-3）和富集（圖 4-6）與 SP4 相比相似或更親水性的蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)聚集驅(qū)動(dòng)了 SP3 中的蛋白質(zhì)捕獲，那么與我們觀察到的 SP4 相比，我們預(yù)計(jì)會(huì)看到具有相似富集水平的相似蛋白質(zhì)。然而，與 SP4 相比，我們觀察到 SP3 鑒定出的親水性蛋白更多，這一事實(shí)表明，與羧酸鹽修飾顆粒的 類HILIC 相互作用也在捕獲 SP3 蛋白中發(fā)揮作用。親水性蛋白質(zhì)對(duì)極性官能團(tuán)（如羧酸鹽）具有更大的親和力，這種親和力基于氨基酸序列中極性和帶電官能團(tuán)的數(shù)量，這些官能團(tuán)可以通過氫鍵、偶極相互作用和鹽橋與羧酸鹽基團(tuán)相互作用。蛋白質(zhì)的氨基酸序列越親水，就越有可能與羧酸鹽修飾的顆粒相互作用。因此，這些結(jié)果表明 SP3 和 SP4 的蛋白質(zhì)捕獲機(jī)制不同，每種純化技術(shù)的蛋白質(zhì)捕獲都取決于蛋白質(zhì)疏水性。

結(jié)論

蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜩b定生物學(xué)相關(guān)樣品中的肽和蛋白質(zhì)，以確定疾病中的重要蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。在此，我們比較了 SP3、SP4、SP3（DA） 和 SP4（DA），并表明 SP3 和 SP4 蛋白質(zhì)捕獲機(jī)制與每種純化技術(shù)的蛋白質(zhì)捕獲不同，具體取決于蛋白質(zhì)疏水性。我們的結(jié)果表明，SP3 通過類 HILIC相互作用和蛋白質(zhì)聚集機(jī)制的組合捕獲蛋白質(zhì)，而 SP4 似乎僅通過蛋白質(zhì)聚集機(jī)制捕獲蛋白質(zhì)。此外，去污劑輔助消化改善了全細(xì)胞裂解物和膜組分中疏水性膜蛋白的鑒定。SP3磁珠請(qǐng)參考http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/1736805216.html。

盡管理想的蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以成功捕獲生物樣品中的所有蛋白質(zhì)，但我們表明 SP3 和 SP4 捕獲不同的蛋白質(zhì)。因此，樣品純化技術(shù)的選擇（SP3 與 SP4）可能會(huì)使蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中鑒定的蛋白質(zhì)產(chǎn)生偏差。為了捕獲具有不同疏水性的多種蛋白質(zhì)，可能需要多種樣品凈化技術(shù)?；蛘?，如果研究人員有興趣鑒定具有預(yù)期疏水性的目標(biāo)一類蛋白質(zhì)，例如預(yù)期具有疏水性的跨膜蛋白，則可以選擇特定的樣品凈化方法，例如 SP4。最終，選擇最佳樣品純化方法可以增加復(fù)雜樣品的蛋白質(zhì)組覆蓋率，這將有助于深入分析蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)細(xì)胞活性和導(dǎo)致疾病方面的重要作用。