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Gel-Based Sample Fractionation with SP3-Purification for Top-Down Proteomics

Ayako Takemori, Naoyuki Sugiyama, Jake T. Kline, Luca Fornelli, and Nobuaki Takemori

Journal of Proteome Research 2025 24 (2), 850-860

DOI: 10.1021/acs.jproteome.4c00941

摘要：蛋白質(zhì)組樣品的精確預(yù)分餾是在自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)中實(shí)現(xiàn)深入分析的有效方法。PEPPI-MS（被動(dòng)洗脫聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質(zhì)作為 MS 的完整物質(zhì)）是一種基于凝膠的樣品分級(jí)分離方法，通過在 SDS-PAGE 分離后從聚丙烯酰胺凝膠中高效提取蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)基于分子量的高分辨率蛋白質(zhì)組分離。此后，在質(zhì)譜分析之前，必須有效地去除 PEPPI 餾分中的 CBB 和 SDS 等污染物。在這項(xiàng)研究中，通過將 PEPPI-MS 與 SP3（單罐固相增強(qiáng)樣品制備）中使用的基于磁珠的蛋白質(zhì)純化方法相結(jié)合，我們開發(fā)了一種完整、穩(wěn)健且簡(jiǎn)單的樣品制備工作流程，用于自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)在 PEPPI-SP3 中，從凝膠中提取的蛋白質(zhì)收集在 SP3 珠子的表面，用有機(jī)溶劑洗滌，并用含有 0.05% （w/v） SDS 的 100 mM 碳酸氫銨完整回收。使用陰離子交換 StageTip 進(jìn)行額外純化后，對(duì)回收的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析。使用人細(xì)胞裂解物進(jìn)行的性能驗(yàn)證顯示，與使用有機(jī)溶劑沉淀或超濾的常規(guī) PEPPI 工作流程相比，低分子量蛋白質(zhì)回收率顯著提高，變異系數(shù)更低。

SP3磁珠請(qǐng)參考 http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/1736805216.html

介紹

單個(gè)基因在體內(nèi)產(chǎn)生具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的各種翻譯產(chǎn)物，稱為蛋白質(zhì)形式。蛋白形式有助于蛋白質(zhì)相互作用和亞細(xì)胞定位的多樣性，從而擴(kuò)展蛋白質(zhì)的生理功能。雖然蛋白質(zhì)形式的總數(shù)仍然未知，但據(jù)估計(jì)，該數(shù)量比人類基因的數(shù)量22,800 個(gè)高出 100 多萬個(gè) 。了解龐大的人類蛋白質(zhì)組學(xué)是當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目標(biāo)之一，為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，迫切需要開發(fā)全面的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)。

自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué) （Bottom-up proteomics, BUP） 是人類蛋白質(zhì)組大規(guī)模分析的主要分析方法，用于分析通過酶消化獲得的肽片段，原則上通常難以應(yīng)用于蛋白質(zhì)形式的高度準(zhǔn)確鑒定。因此，允許直接分析完整蛋白質(zhì)形式的自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué) （Top-down proteomics, TDP） 被用作用于此目的的主要分析方法。在 TDP 分析中，樣品制備的影響不容小覷，正如 Kaulich 等人最近的一份報(bào)告中所詳細(xì)描述的那樣。蛋白質(zhì)形態(tài)鑒定通常是通過反相液相色譜 （LC） 或毛細(xì)管電泳 （CE） 分離完整的蛋白質(zhì)形態(tài)，然后在線連接質(zhì)譜儀中碎裂來實(shí)現(xiàn)的。然而，為了從生物樣品中檢測(cè)出更多的蛋白質(zhì)組分，在 LC/CE 分離之前進(jìn)行樣品預(yù)分餾是必不可少的。

       SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （PAGE） 是生化實(shí)驗(yàn)中的一種核心蛋白質(zhì)分離方法，通過在聚丙烯酰胺凝膠中添加陰離子表面活性劑 SDS，根據(jù)分子量 （MW） 對(duì)線性化蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離。SDS-PAGE 的特性能夠?qū)?xì)胞裂解物中的復(fù)雜蛋白質(zhì)組進(jìn)行高分辨率分離，并被廣泛用作 BUP 中一種強(qiáng)大的樣品預(yù)分餾方法。2020 年，我們開發(fā)了 PEPPI-MS，這是一種用于被動(dòng)提取凝膠中蛋白質(zhì)的高效方法，并成功地顯著提高了凝膠中蛋白質(zhì)的回收率。盡管被動(dòng)提取通常簡(jiǎn)單且具有成本效益，但它也與低回收率、長(zhǎng)提取時(shí)間和難以應(yīng)用于高 MW 蛋白質(zhì)有關(guān)。PEPPI-MS 通過使用考馬斯亮藍(lán) （CBB） 和 SDS 作為提取增強(qiáng)劑解決了這些缺點(diǎn)，即使對(duì)于高 MW 蛋白，也能在 10 分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)高回收率。

在 PEPPI-MS 中，蛋白質(zhì)組按如下方式分級(jí)分離：（1） 通過 SDS-PAGE 分離后在凝膠中添加 CBB，（2） 切除感興趣 MW 區(qū)域的樣品泳道，（3） 將凝膠塊搗碎并在含有 0.05–0.1% （w/v） SDS 的 100 mM 碳酸氫銨溶液 （pH 8） 中被動(dòng)萃取 10 分鐘。由于獲得的餾分含有 CBB 和 SDS， 這會(huì)干擾 MS 分析，因此蛋白質(zhì)純化是必不可少的，目前使用甲醇-氯仿-水沉淀 （MCW） 或陰離子交換轉(zhuǎn)盤輔助順序樣品制備 （AnExSP）。MCW 適用于約 300 μL 的小體積溶液，例如 PEPPI 餾分，是一種廉價(jià)且簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)純化方法。AnExSP 是一種使用陰離子交換固相萃取 （SPE） 微量離心柱（稱為 AX-StageTip）從樣品中去除 SDS 和 CBB 的方法。AnExSP 允許純化 PEPPI 組分，而不會(huì)損失低 MW 蛋白，這通常是 MCW 的一個(gè)問題。在 AnExSP 中，CBB、SDS 和 PEPPI 餾分中的蛋白質(zhì)最初被捕獲在 StageTip 的陰離子交換 SPE 盤上，在隨后的洗脫過程中，使用乙醇和/或含有甲酸 （FA） 的乙腈溶液回收蛋白質(zhì)。然而，標(biāo)準(zhǔn) 300 μL PEPPI 餾分中的 SDS 量超過了 AX-StageTip 可能去除的限度，需要事先進(jìn)行 FASP 處理，這是一種使用離心超濾裝置進(jìn)行繁瑣的尿素清洗。

在本研究中，我們嘗試開發(fā)一種使用 SP3 進(jìn)行 PEPPI 分級(jí)分離的新純化方法，SP3 是目前 BUP 的主流樣品預(yù)處理方法。 在 SP3 中，通過添加有機(jī)溶劑（如乙醇或乙腈）沉淀的蛋白質(zhì)被吸附到羧酸鹽修飾的磁珠表面，回收的蛋白質(zhì)直接在磁珠上進(jìn)行酶消化。通過可靠、簡(jiǎn)單的作選擇性回收蛋白質(zhì)，可有效去除 SDS 和其他污染物，其特點(diǎn)是在處理痕量蛋白質(zhì)樣品時(shí)具有很高的重現(xiàn)性。結(jié)合最近開發(fā)的用于多樣品高通量處理的商業(yè)自動(dòng)化系統(tǒng)，該方法可應(yīng)用于多樣品處理。SP3磁珠請(qǐng)參考 http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/1736805216.html

盡管 SP3 具有出色的樣品純化特性，但目前其在 TDP 中的應(yīng)用受到限制，部分原因是難以回收吸附在磁珠上的完整蛋白質(zhì)。Webb 小組的一項(xiàng)開創(chuàng)性研究報(bào)告稱，在 ?80 °C 下用 80% （v/v） FA 孵育可有效從磁珠中回收完整蛋白質(zhì)，但條件對(duì)于高通量應(yīng)用來說太苛刻了。 為了使 SP3 適應(yīng) TDP，我們開發(fā)了新的實(shí)驗(yàn)條件，允許在室溫下從磁珠中快速且可重現(xiàn)地回收蛋白質(zhì)，從而為TDP 提供了一種簡(jiǎn)化而高效的樣品分離工作流程，該工作流程結(jié)合了基于 PEPPI 的蛋白質(zhì)組分分離和基于磁珠的餾分純化，稱為 PEPPI-SP3。PEPPI-SP3 實(shí)現(xiàn)的基于 MW 的高分辨率蛋白質(zhì)組分離可最大限度地減少低 MW 蛋白的損失，從而實(shí)現(xiàn)高通量樣品制備、全面分析，并最終實(shí)現(xiàn)多樣品處理。

實(shí)驗(yàn)部分

補(bǔ)充方案中給出了先前發(fā)布的程序（如樣品制備、SDS-PAGE、PEPPI 分級(jí)分離和蛋白質(zhì)純化）的詳細(xì)方案。

材料

除非另有說明，否則用于 PEPPI 分級(jí)分離和蛋白質(zhì)純化的試劑購(gòu)自 Wako（日本大阪），用于 TDP 分析的試劑購(gòu)自 Fisher Scientific（美國(guó)伊利諾伊州羅克福德）。

細(xì)胞樣品

本研究使用了 MS 相容的人蛋白提取物 （Promega， Madison， WI， USA），一種市售的人類細(xì)胞蛋白提取物 （HCPE）。在 SDS-PAGE 之前，通過將 100 μL HCPE（1 mg 蛋白質(zhì)）與 1 μL 500 mM 二硫蘇糖醇 （DTT） 在 37 °C 下孵育 90 分鐘進(jìn)行還原處理，然后通過在 23 °C 下與 1 μL 1 M 碘乙酰胺在黑暗中孵育 30 分鐘進(jìn)行烷基化處理。在 Amicon 離心式 3 kDa 超濾裝置（Merck Millipore，達(dá)姆施塔特，德國(guó)）中用 0.05% （w/v） SDS/100 mM 碳酸氫銨 （ABC） 替換溶劑，并調(diào)節(jié)至 2 μg/μL 的蛋白質(zhì)濃度。

SDS-PAGE

使用 4–12% 預(yù)制凝膠 NuPAGE bis-tris（1 mm 厚，10 孔）和 NuPAGE MES 電泳緩沖液（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）進(jìn)行 SDS-PAGE。將樣品與 NuPAGE LDS 上樣緩沖液 （Thermo） 混合，然后上樣到凝膠孔中。在 180 V 的恒定電壓下進(jìn)行電泳后，從凝膠盒中取出凝膠，用 EzStain AQua（ATTO，Tokyo，Japan）染色 8 分鐘，然后用去離子水洗滌 30 分鐘至 1 小時(shí)。對(duì)于 TDP，進(jìn)行了以下調(diào)整：使用自制的 10% 凝膠（1 mm 厚，10 孔）代替 NuPAGE 4–12% 凝膠（1 mm 厚，10 孔），并使用 Bio-Safe 考馬斯染色劑（Bio-Rad，Hercules，CA）染色 60 分鐘，而不是 EzStain AQua 染色 8 分鐘。

PEPPI 分級(jí)分離

使用 MW 標(biāo)記作為指示劑，用工藝刀在感興趣的 MW 區(qū)域?qū)θ旧z的樣品泳道進(jìn)行切片。將切除的凝膠塊收集在 BioMasher II 管（Nippi，Tokyo，Japan）中，并用塑料杵精細(xì)研磨。將凝膠進(jìn)一步與 250 μL 0.05% （w/v） SDS/100 mM ABC 混合，并在管式混合器中以 23 °C、1500 rpm 搖動(dòng) 10 分鐘。使用離心過濾器去除凝膠，所得溶液（約 250 μL），即 PEPPI 組分，用于后續(xù)的蛋白質(zhì)純化：MCW、FASP 或 SP3。

MCW

將 PEPPI 餾分轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 微管中，加入 600 μL 甲醇、150 μL 氯仿和 400 μL 超純水，混合，并在 23 °C 下以 13,500 rpm 離心 3 min。 離心形成雙層溶液，其中去除上層，向剩余的底層加入 400 μL 甲醇，并在 23 °C 下以 13,500 rpm 離心 3 分鐘。 用 400 μL 甲醇洗滌所得蛋白質(zhì)沉淀物，并風(fēng)干 30 分鐘。

FASP

將 PEPPI 餾分轉(zhuǎn)移至 Amicon 離心式 3 kDa 超濾裝置中，然后用 8 M 尿素置換溶劑，再用 100 mM ABC 置換溶劑。如前所述，通過 AnExSP（自制 AX-StageTip）純化裝置中的溶液：（11） 使用前用甲醇洗滌 AX-StageTip 并用 100 mM ABC 平衡;將樣品上樣至 AX-StageTip 上，用 40 μL 100 mM ABC 洗滌，用 40 μL 0.5% （v/v） FA/50% （v/v） 乙醇洗脫，再用 40 μL 0.5% （v/v） FA/50% （v/v） 乙腈洗脫，最后三個(gè)步驟分別以 7000 rcf 離心 3 分鐘。在 LC-MS 分析之前，將所得洗脫液在離心蒸發(fā)器中干燥。

SP3

SP3磁珠請(qǐng)參考 http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/1736805216.html。將購(gòu)自 Cytiva（美國(guó)馬薩諸塞州馬爾堡）的 Sera-Mag SpeedBead 羧酸鹽修飾的 E7 磁珠（50 mg/mL，貨號(hào) 45152105050250）和 E3 磁珠（50 mg/mL，貨號(hào) 65152105050250）各 50 μL 添加到 1.5 mL 微管中。用 800 μL 超純水洗滌 3 次后，將珠子懸浮在 250 μL 超純水中并儲(chǔ)存在 4 °C 直至使用。將先前制備的 PEPPI 組分轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 微管中，并與 25 μL SP3 珠懸浮液 （20 μg/μL） 和 1.2 mL 乙醇混合;在 23 °C 下以 1200 rpm 振蕩 10 分鐘后，將微管置于磁力架上 3 分鐘，并通過抽吸除去液體。用 800 μL 80% （v/v） 乙醇洗滌磁珠兩次，用 800 μL 乙腈洗滌一次。為了回收吸附在磁珠上的完整蛋白質(zhì)，在 23 °C 下用 20 μL 0.05% （w/v） SDS/100 mM ABC 在微管中以 2000 rpm 振蕩磁珠 5 分鐘。 將微管置于磁力架上 3 分鐘，并如上所述在 fasp 后半部分對(duì)含有回收蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行 AnExSP 純化。

ContamSpot 檢測(cè)

通過 ContamSpot 測(cè)定法測(cè)定純化后 PEPPI 組分的殘留 SDS 濃度。（19） 將純化的 PEPPI 餾分溶于 10 μL 0.1% （v/v） FA/2% （v/v） 乙腈中，用于測(cè)定。將 2 μL 樣品、2 μL 0.1% （w/v） 鄰甲苯胺藍(lán)和 5 μL 乙酸乙酯混合在 0.2 mL PCR 管中，并以 2000 rpm 離心 15 秒。從通過離心分離成兩層的溶液中，將 1.5 μL 乙酸乙酯層點(diǎn)樣到薄層色譜 （TLC） 板上。

胰蛋白酶/Lys-C 消化

在 LC-MS 分析之前，使用 RapiGest（沃特世，美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德）溶解 PEPPI 餾分，并使用 MS 級(jí)胰蛋白酶/賴氨酸-C 混合物 （Promega） 消解。將來自不同 4 個(gè) MW 區(qū)域的純化 PEPPI 組分溶于 10 μL 0.1% （w/v） RapiGest/100 mM ABC 中，并混合在 1.5 mL 微管中。將混合級(jí)分（總共 40 μL）與 0.2 μg 胰蛋白酶/賴s-C 混合物混合，并在 37 °C 下消化 16 小時(shí)。 為了降解 RapiGest，向消解的樣品中加入 10 μL 2.5% （v/v） 三氟乙酸 （TFA），并在 37 °C 下孵育 30 分鐘。 在 23 °C 下以 13,500 rcf 離心 10 分鐘后，通過自制的 SDB-StageTip 純化上清液并進(jìn)行 LC-MS 分析。

消化肽的 NanoLC/MS/MS

在 timsTOF Pro2 質(zhì)譜儀（Bruker Daltonics，Bremen，Germany）上使用 CaptiveSpray 納離子噴霧源 （Bruker Daltonics） 結(jié)合 nanoElute 2 納流 UHPLC 系統(tǒng) （Bruker Daltonics） 獲取 MS 和 MS/MS 數(shù)據(jù)。在 50 °C 下，使用 PepSep ULTRA C18（250 mm × 75 μm、1.5 μm，Bruker Daltonics）作為分析柱。 將干燥的肽混合物溶于 30 μL 0.1% （v/v） TFA 和 5% （v/v） 乙腈中，每次進(jìn)樣使用 2 μL 溶液進(jìn)行 LC/MS/MS。流速為 400 nL/min，流動(dòng)相由 （A） 0.1% （v/v） FA 的水溶液和 （B） 0.1% （v/v） FA 的乙腈溶液組成。采用多級(jí)線性梯度：流動(dòng)相B在60 min內(nèi)從4%增加至20%，在30 min內(nèi)從20%增加至28%，在15 min內(nèi)從28%增加至40%，在5 min內(nèi)從40%增加至100%，并在100% B下保持10 min。

timsTOF 在 PASEF （parallel accumulation and serial fragmentation） 模式下運(yùn)行。施加 1500 V 的毛細(xì)管電壓、3.0 L/min 的干燥氣體和 180 °C 的干燥溫度。MS 和 MS/MS 掃描范圍為 m/z 100–1700,1/K₀ 范圍為 0.6 至 1.6 Vs/cm²，斜坡時(shí)間為 100 ms，累積時(shí)間為 100 ms。碰撞能量根據(jù)離子淌度線性遞增，從 1/K₀ = 1.60 Vs/cm² 的 59 eV 到 1/K₀ = 0.60 Vs/cm² 的 20 eV。對(duì)于數(shù)據(jù)依賴性采集 （DDA） 分析，每個(gè)周期進(jìn)行 1 次 MS 掃描和 10 次 PASEF MS/MS 掃描，預(yù)定目標(biāo)強(qiáng)度為 20,000。使用多邊形過濾器，根據(jù) m/z 和離子淌度選擇單電荷和低 m/z 離子，從源離子母離子選擇中排除。主動(dòng)排除時(shí)間設(shè)置為 0.4 min。對(duì)于數(shù)據(jù)非依賴型采集 （DIA） 分析，DIA 窗口設(shè)置如表 S1 所示。MS 原始數(shù)據(jù)和分析文件已通過 jPOST 合作伙伴存儲(chǔ)庫(kù) （https://jpostdb.org） 存放到 ProteomeXchange Consortium （http://proteomecentral.proteomexchange.org），數(shù)據(jù)集標(biāo)識(shí)符為 PXD056413。

DDA 和 DIA 分析

使用 MSFragger （v. 4.1） FragPipe （v. 22.0）  處理 DDA 數(shù)據(jù)，以鑒定肽和蛋白質(zhì)，并生成用于 DIA 數(shù)據(jù)分析的光譜庫(kù)。根據(jù)人類 SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（2024 年 4 月 16 日從 UniProtKB 下載，僅限規(guī)范，40,870 個(gè)條目，包含 20,435 個(gè)反向誘餌）搜索 MS/MS 譜圖。將母離子和子離子的質(zhì)量精度設(shè)置為 20 ppm，并啟用質(zhì)量校準(zhǔn)和參數(shù)優(yōu)化。將酶特異性設(shè)置為胰蛋白酶/P，允許最多一個(gè)缺失的切割位點(diǎn)。半胱氨酸的氨基甲酰甲基化被設(shè)置為固定修飾，蛋氨酸的氧化和蛋白質(zhì) N 末端的乙酰化被允許為可變修飾。使用 Philosopher 中的 PeptideProphet 和 ProteinProphet 過濾結(jié)果，F(xiàn)DR < 1%。用于 DIA 數(shù)據(jù)分析的光譜庫(kù)是根據(jù)所有 DDA 數(shù)據(jù)的結(jié)果生成的。

對(duì)于 DIA 數(shù)據(jù)，通過 FragPipe （v. 22.0） 用 DIA-NN （v. 1.8.2 beta 8） 定量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)水平 FDR < 1%。針對(duì)不同的運(yùn)行分別確定質(zhì)量精度和掃描窗口。定量結(jié)果使用 MetaboAnalyst （v. 6.0） 和 PlotsOfData 可視化。

自上而下的樣品制備、PEPPI 分級(jí)分離和處理

在手鑄的 10% SDS-PAGE 上分離 9 個(gè) 40 μg 的 HCPE 樣品，切除對(duì)應(yīng)于 0-30 kDa 的區(qū)域，并如上所述進(jìn)行 PEPPI。如上所述，用 MCW 、 FASP 和 SP3 方法處理 3 組。請(qǐng)注意，在濃縮之前，將 AnExSP 處理的樣品在液氮中快速冷凍。使用 SpeedVac 進(jìn)行溶劑蒸發(fā)，不加熱，直到樣品體積減少至 ～5 μL（約 60–120 分鐘;因樣品而異）。濃縮后，使用 0.1% （v/v） FA、4.9% （v/v） 乙腈的 LC-MS 級(jí)水溶液將樣品體積定為 20 μL。

色譜和自上而下的質(zhì)譜

通過納米毛細(xì)管高性能液相色譜在線與 EasySpray 納離子噴霧離子源（Thermo Fisher Scientific，加利福尼亞州圣何塞）聯(lián)用，進(jìn)一步分離重懸的 HCPE 餾分（FASP 和 SP3 樣品進(jìn)樣體積為 2 μL，MCW 進(jìn)樣體積為 3.5 μL）。使用Ultimate 3000色譜系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行反相液相色譜，將流動(dòng)相B的梯度從5%提高到2 min從5%提高到14%，然后在50 min內(nèi)從14%提高到42%，然后連續(xù)兩次以85% B清洗色譜柱，持續(xù)1 min，最后以5% B再平衡相，持續(xù)8.5 min， 保持 1.5 μL/min 的流速。流動(dòng)相A由4.9% （v/v）乙腈水溶液在0.1% （v/v） FA中存在而成，而流動(dòng)相B由4.9% （v/v）水的乙腈溶液和0.1% （v/v） FA組成。所有流動(dòng)相組分均為L(zhǎng)C-MS純度等級(jí)（Fisher Scientific）。將樣品直接進(jìn)樣到帶有集成發(fā)射器的 MAbPac EasySpray 色譜柱上（Thermo Fisher Scientific;粒徑 4 μm，長(zhǎng)度 15 cm，內(nèi)徑 150 μm），使用集成的 EasySpray 柱溫箱加熱至 55 °C。通過施加 2.1–2.2 kV 電位產(chǎn)生納電噴霧。所有質(zhì)譜測(cè)量均在配備 FAIMS Pro 裝置的 Orbitrap Eclipse 三組質(zhì)譜儀 （Thermo Fisher Scientific） 上進(jìn)行。在“蛋白質(zhì)模式”下進(jìn)行自上而下的實(shí)驗(yàn)，離子路由多極壓力為 3 mTorr。源區(qū)域參數(shù)包括加熱傳輸毛細(xì)管的 320 °C 溫度、30% RF 振幅和 15 V 源內(nèi)碎裂，以促進(jìn)脫溶劑和去除不穩(wěn)定的加合物。對(duì)于 DDA，使用 5 × 10⁵充電和 50 ms 的自動(dòng)增益控制 （AGC） 目標(biāo)，最大進(jìn)樣時(shí)間為 50 ms，最大進(jìn)樣時(shí)間為 50 ms，在 400–2000 m/z 窗口內(nèi)以 120,000 分辨能力（200 m/z 時(shí)）以 120,000 m/z 的分辨率（即單次微掃描）鑒定母離子。選擇四極桿（3 m/z 隔離窗口）進(jìn)行 HCD MS² 碎裂（35% 歸一化碰撞能量），在 5–50+ 的電荷態(tài)范圍內(nèi)，強(qiáng)度閾值為 2.5 × 10⁴。在 Orbitrap 質(zhì)量分析器中收集碎裂譜圖，在 400–2000 m/z 窗口內(nèi)，無光譜平均，AGC 目標(biāo)為 2.5 × 10⁵ 次充電，最大進(jìn)樣時(shí)間為 500 ms。FAIMS 補(bǔ)償電壓 （CV） 在單次運(yùn)行中變化，每個(gè)樣品單獨(dú)運(yùn)行 3 次（每個(gè)樣品總共 9 個(gè)不同的 CV）， 與之前的報(bào)告類似;（29） 運(yùn)行 1：?40、?20 和 0 V;運(yùn)行 2：?60、?50 和 ?30 V;運(yùn)行 3：?10、5 和 15 V;每個(gè) CV 使用 1.2 s 的循環(huán)時(shí)間。應(yīng)用動(dòng)態(tài)排除（持續(xù)時(shí)間 30 s）。所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件均已上傳到 MassIVE（存儲(chǔ)庫(kù)編號(hào) MSV000095992）

自上而下的數(shù)據(jù)分析

將來自所有三種處理方法的 RAW 文件與 ProSight PD v. 4.2 （Proteinaceous， Inc.， Evanston， IL， USA） 一起搜索，在 Proteome Discoverer 3.0 環(huán)境 （Thermo Fisher Scientific） 中作為節(jié)點(diǎn)運(yùn)行，對(duì)照人類數(shù)據(jù)庫(kù)。使用提供的 High-High 處理和共識(shí)工作流程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于 FAIMS 文件，Spectrum Selector （光譜選擇器） 節(jié)點(diǎn)中的 FAIMS CV 設(shè)置未指定，以適應(yīng)每個(gè)文件使用多個(gè) CV。所有譜圖都在 High-High cRAWler 節(jié)點(diǎn)內(nèi)進(jìn)行去卷積：使用 Xtract 利用滑動(dòng)窗口算法從 MS¹ 譜圖中去除母離子質(zhì)量數(shù)，掃描偏移量為 1，合并容差為 30 ppm，同時(shí)要求在至少 3 個(gè)滑動(dòng)窗口檢測(cè)中檢測(cè)至少 3 種電荷態(tài)。在共識(shí)工作流程中定量之前，特征組需要 2.2 Da 的耐受性。應(yīng)用了兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索：使用 2.2 Da 母離子質(zhì)量容差的注釋蛋白形式搜索，以及基于 15 ppm 母離子容差的子序列搜索。對(duì)于這兩個(gè)檢索，片段容差均設(shè)置為 10 ppm。由單個(gè)前體產(chǎn)生的蛋白形式數(shù)量限制為 1。從 ProSight PD 中鑒定出的蛋白質(zhì)形式和 UniProt 登錄號(hào)以 1% FDR 過濾（對(duì)蛋白質(zhì)形式、同工型和 UniProt 登錄水平進(jìn)行三次單獨(dú)的 FDR 計(jì)算）。完成數(shù)據(jù)庫(kù)搜索后，針對(duì)每種處理方法過濾生成的 tdReport，并根據(jù)開發(fā)人員的建議重新計(jì)算 Q 值。對(duì)于水腫總平均值 （GRAVY）  和等電點(diǎn) （pI） 分析，使用 GraphPad Prism 10 （GraphPad Software， Boston， MA， USA） 中的內(nèi)置函數(shù)，使用 Kruskal-Wallis 和 Dunn 多重檢驗(yàn)校正，根據(jù)每組的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。使用 DeepTMHMM 預(yù)測(cè)鑒定蛋白質(zhì)的跨膜狀態(tài)。繪圖是使用 GraphPad Prism 10 生成的。

結(jié)果與討論

通過 SP3 純化 PEPPI 組分

我們嘗試根據(jù)先前發(fā)布的 BUP¹⁵ 方案，以 250 μL 的樣品規(guī)模（典型的 PEPPI 餾分體積）建立 TDP 的 SP3 方案。使用的磁珠是兩種不同羧酸鹽修飾磁珠的等重混合物，即 Cytiva Sera-Mag SpeedBead 羧酸鹽修飾磁珠的親水和疏水版本。在 BUP 的 SP3 樣品制備中，通常建議在蛋白質(zhì)中添加 10 倍重量的磁珠。 為了應(yīng)用于 TDP，我們從 10 μg HCPE 中生成了四種不同 MW 范圍的 PEPPI 級(jí)分，并檢查了當(dāng)添加不同量的珠子時(shí)與珠子結(jié)合的蛋白質(zhì)量（圖 S1）。在 250 至 20 kDa 的 MW 范圍內(nèi)，無論添加的磁珠量如何，回收率都相似，但在低于 20 kDa 的范圍內(nèi)，當(dāng)添加的磁珠量小于 500 μg 時(shí)，回收率略有下降。因此，我們?cè)诒狙芯恐袑⒅樽拥牧吭O(shè)置為 500 μg。

為了在室溫 （23–25 °C） 下快速回收磁珠上緊密吸附的蛋白質(zhì)，我們認(rèn)為需要表面活性劑輔助，并選擇使用 SDS，它可以被 AnExSP 去除。具體來說，我們將 20 μL 0.05% （w/v） SDS/100 mM ABC（之前已被證明適用于 AX-StageTip 純化）與洗滌的珠子混合，并在室溫下用試管振蕩器搖動(dòng)混合物（圖 1A）。HCPE 分析表明，0.05% （w/v） SDS/100 mM ABC 可以在 10 分鐘內(nèi)從珠子中回收蛋白質(zhì)（圖 1B）。作為 SDS 的替代品，我們還研究了 RapiGest、尿素、NDSB-195 和辛基葡糖苷的使用，這些物質(zhì)可以在 MS 分析前輕松去除。尿素、NDSB-195 和辛基葡萄糖苷在搖動(dòng) 10 分鐘后沒有產(chǎn)生任何顯著的蛋白質(zhì)回收（圖 S2），可酸降解表面活性劑 RapiGest 產(chǎn)生相當(dāng)于 SDS，但隨后的酸處理導(dǎo)致回收的蛋白質(zhì)降解（圖 S3）。因此，我們決定在本研究中繼續(xù)使用 SDS 進(jìn)行蛋白質(zhì)回收。

圖 1.使用 SDS 溶液從 SP3 微珠中回收蛋白質(zhì)。（A） 從 SP3 微珠中回收蛋白質(zhì)。通過在 23 °C 下在 20 μL 0.05% （w/v） SDS/100 mM ABC 中搖動(dòng)珠子 10 分鐘（左圖），回收吸附在 SP3 珠子 （500 μg） 上的 HCPE （10 μg）。蛋白質(zhì)回收后，將試管放在磁力架上以去除磁珠（右）。（B） 從不同 SDS 濃度 （0.01–1% （w/v）） 的磁珠中回收的蛋白質(zhì)的 SDS-PAGE 圖像。條帶用 CBB 染色。SP3磁珠請(qǐng)參考 http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/1736805216.html

PEPPI-SP3 工作流程

基于上述結(jié)果，我們建立了一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)工作流程 PEPPI-SP3，通過在 AnExSP 純化后結(jié)合基于 SP3 的蛋白質(zhì)回收來純化 PEPPI 組分（補(bǔ)充方案）。PEPPI-SP3 工作流程的方案如圖 2 所示。在工作流程中，蛋白質(zhì)組學(xué)樣品通過 SDS-PAGE 分離，然后用 PEPPI 進(jìn)行分級(jí)分離。將乙醇添加到 500 μg SeraMag 珠子和所得 PEPPI 級(jí)分中，以產(chǎn)生 80% （v/v） 乙醇溶液，并劇烈搖動(dòng)以將沉淀的蛋白質(zhì)成分吸附到珠子上（圖 S4A 和 S4B）。使用磁力架分離珠子，并用 80% （v/v） 乙醇洗滌兩次，用乙腈洗滌一次，以去除 CBB 和 SDS（圖 S4C-S4E）。通過用 0.05% （w/v） SDS/100 mM ABC 搖動(dòng)珠子 10 分鐘，從珠子中回收蛋白質(zhì)，并在 AnExSP 純化后進(jìn)行 LC-MS。

圖 2.用于自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)的 PEPPI-SP3 工作流程。（A） PEPPI 分級(jí)分離。樣品 SDS-PAGE 分離后，用 CBB 對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，并切除樣品泳道中所需的分子量范圍。使用一次性塑料搗碎管對(duì)切除的凝膠塊進(jìn)行勻漿，并用 0.05% （w/v） SDS/100 mM ABC 被動(dòng)提取凝膠中的蛋白質(zhì)。（B） 蛋白與 SP3 微珠的結(jié)合。將蛋白質(zhì)回收溶液（PEPPI 組分）與 SP3 珠子和乙醇混合，攪拌，沉淀的蛋白質(zhì)吸附到珠子上。（C） 磁珠洗滌和蛋白質(zhì)回收。用 80% （v/v） 乙醇洗滌珠子兩次，用乙腈洗滌一次，然后與 20 μL 0.05% （w/v） SDS/100 mM ABC 混合，以從珠子中回收蛋白質(zhì);攪拌 5 分鐘后，用磁鐵去除磁珠，并用 AX-StageTip 純化所得蛋白質(zhì)溶液。SP3磁珠請(qǐng)參考 http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/1736805216.html

將吸附在磁力架上的磁珠風(fēng)干 10 分鐘。傳統(tǒng)的 PEPPI 工作流程使用 （1） PEPPI-MCW 與 MCW 沉淀或 （2） PEPPI-FASP 結(jié)合 FASP 和 AnExSP。PEPPI-MCW 從電泳到純化的時(shí)間為 2.3 小時(shí)，PEPPI-FASP 為 5.3 小時(shí)，而 PEPPI-SP3 需要 3.4 小時(shí)（圖 S5）;FASP 是一個(gè)相對(duì)耗時(shí)的過程，通過使用 SP3 已得到極大的改進(jìn)。

接下來，我們通過與 PEPPI-MCW 和 PEPPI-FASP 的比較驗(yàn)證了 PEPPI-SP3 的性能。根據(jù)相應(yīng)的工作流程處理來自 10 μg HCPE 的 PEPPI 級(jí)分，并使用納米 LC-MS 通過 DIA 進(jìn)行 SDS-PAGE 和定量蛋白質(zhì)組學(xué)。圖 3 顯示了從每個(gè)工作流程獲得的 PEPPI 級(jí)分的 SDS-PAGE 結(jié)果，CBB 染色圖像顯示，在 100 kDa 以上的高 MW 區(qū)域和低于 20 kDa 的低 MW 區(qū)域，工作流程之間存在很大差異。我們以前的研究已經(jīng)表明，AnExSP 不適用于高 MW 蛋白;與 MCW 相比，使用 AnExSP 進(jìn)行蛋白質(zhì)純化（FASP 和 SP3）的工作流程對(duì) 100 kDa 以上的蛋白質(zhì)的回收率往往較低。在低于 20 kDa 的 MW 區(qū)域，已知通常會(huì)導(dǎo)致低 MW 蛋白回收損失的 MCW 加工顯示，與 FASP 和 SP3 相比，回收的蛋白質(zhì)量預(yù)期減少。最后，比較 FASP 和 SP3，注意到用 SP3 處理的餾分具有比 FASP 更高的譜帶密度，表明 SP3 在小于 20 kDa 的區(qū)域具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這是當(dāng)前 TDP 分析的主要目標(biāo)區(qū)域。通過 ContamSpot 分析評(píng)估純化級(jí)分中 SDS 的水平，顯示 SP3 處理的級(jí)分的 SDS 水平低于 0.002% （w/v），并且純化結(jié)果與 MCW 相當(dāng)（圖 S6）。即使將 HCPE 從 10 μg 增加到 40 μg（圖 S7），每個(gè)工作流程對(duì)餾分的純化結(jié)果與 10 μg 時(shí)的結(jié)果相似，SP3 在 20 kDa 以下的性能明顯好得多。

圖 3.通過三種不同方法純化的 PEPPI 組分的 SDS-PAGE 圖像。通過三種不同的方法（MCW、FASP和SP3）純化來自10 μg HCPE的四種PEPPI組分（245-100 kDa、100-48 kDa、48-20 kDa;<20 kDa），并通過SDS-PAGE再次分離這些組分。凝膠分離的組分用 CBB 染色。

對(duì)于 DIA 分析，將組分合并，用胰蛋白酶/Lys-C 消化，并進(jìn)行全蛋白質(zhì)組定量（圖 4A）。我們的分析在所有三個(gè)工作流程中共檢測(cè)到 5379 個(gè)蛋白質(zhì)（表 S2），每個(gè)工作流程中檢測(cè)到的數(shù)量幾乎沒有差異（圖 4B），并且在所有三個(gè)工作流程中都檢測(cè)到許多組分 （5016）。圖 S8 顯示了兩種不同工作流程（SP3 與 MCW 或 SP3 與 FASP）之間 DIA 定量的比較結(jié)果：在 SP3 與 MCW 的情況下，每種方法顯示顯著變化的蛋白質(zhì)數(shù)量（>3 倍，p < 0.05）相似（MCW：229 和 SP3：197）。在這些蛋白質(zhì)中，在 MCW 中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)顯示更多氨基酸長(zhǎng)度較長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，而在 SP3 中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)顯示更多氨基酸長(zhǎng)度較短的蛋白質(zhì)（<300 個(gè)氨基酸）（圖 4C），這一趨勢(shì)與 SDS-PAGE 結(jié)果中觀察到的趨勢(shì)一致。在 SP3 與 FASP 的情況下（圖 S8），顯示顯著差異的蛋白質(zhì)在 SP3 中的豐度是 FASP 中的三倍（FASP：76 和 SP3：220），并且 SP3 中豐富的大多數(shù)蛋白質(zhì)是氨基酸殘基少于 300 個(gè)的蛋白質(zhì)（圖 4C）。這些結(jié)果表明，當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)是低 MW 蛋白時(shí)，SP3 是首選工作流程。事實(shí)上，當(dāng)考慮組蛋白（TDP 中蛋白質(zhì)形式分析的重要靶標(biāo)）時(shí)，SP3 對(duì)本研究中檢測(cè)到的所有 15 種組蛋白都顯示出比其他兩種更好的恢復(fù)結(jié)果（圖 S9）。相比之下，對(duì)于 TDP 分析仍未開發(fā)的高 MW 蛋白，MCW 將是首選工作流程。我們還使用 DIA 數(shù)據(jù)評(píng)估了每個(gè)工作流程的定量準(zhǔn)確性。圖 4D 顯示了小提琴圖中每個(gè)工作流程的變異系數(shù) （CV） 分布，表明 SP3 在定量準(zhǔn)確度方面優(yōu)于其他工作流程。與其他工作流程相比，F(xiàn)ASP 的定量精度較低，這可能是由于超濾過濾器上的蛋白質(zhì)吸附損失所致。

圖 4.通過 DIA 定量評(píng)估不同的 PEPPI 工作流程。（A） 使用 PEPPI-MCW （MCW）、PEPPI-FASP （FASP） 和 PEPPI-SP3 （SP3） 三種 PEPPI 工作流程從 10 μg HCPE 中鑒定的蛋白質(zhì)的比較，混合賴斯-C/胰蛋白酶，并通過 LC-MS 進(jìn)行 DIA 分析。（B） 維恩圖顯示了每個(gè)工作流程中鑒定的蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。（C） 蛋白質(zhì)中氨基酸長(zhǎng)度的比較，如圖 S8 所示的顯著差異。（D） 每個(gè)工作流程中鑒定的蛋白質(zhì)組的 CV 分布。圓圈表示中位數(shù)。

PEPPI-SP3 組分的 TDP 分析

接下來，我們通過將 PEPPI-SP3 方法與 PEPPI-MCW 和 PEPPI-FASP 方案進(jìn)行比較，驗(yàn)證了 PEPPI-SP3 方法對(duì) TDP 的性能。為了進(jìn)行此比較，對(duì) 40 μg HCPE 的三個(gè)技術(shù)重復(fù)進(jìn)行 PEPPI 分級(jí)，以生成每種處理方法的 0-30 kDa 餾分（圖 S10）。在用相應(yīng)的方法（MCW、FASP 和 SP3）處理后，使用 FAIMS-HiHi 方法分析樣品，該方法依賴于內(nèi)部補(bǔ)償電壓 （CV） 步進(jìn)，（32） 三次運(yùn)行中的每一次都使用三個(gè)不同的 CV 值（即，每個(gè)樣品總共經(jīng)受 9 個(gè) CV）以增加所研究蛋白質(zhì)組的深度。

總體而言，PEPPI-SP3 方法在多個(gè)指標(biāo)上表現(xiàn)出優(yōu)于其他兩種方法的顯著優(yōu)勢(shì)。相對(duì)于 MCW 方法，它顯著增加了 60% 的 UniProt 種質(zhì)數(shù)量和 85% 的蛋白質(zhì)組鑒定數(shù)量（圖 5A）。雖然與 MCW 方法相比，F(xiàn)ASP 方法確實(shí)增加了鑒定結(jié)果，但它比 SP3 的鑒定數(shù)量少了約 20%。根據(jù)對(duì) ?40 V 補(bǔ)償電壓的總離子色譜圖 （TIC） 的目視檢查，鑒定數(shù)量的差異并不奇怪，該 CV 值導(dǎo)致每種方法鑒定出大多數(shù)蛋白質(zhì)形式（圖 S11）。通過將全局 TIC 強(qiáng)度歸一化為 SP3 樣品，F(xiàn)ASP 樣品顯示信號(hào)降低 ～ 35%。然而，當(dāng)在 SP3 和 MCW 之間進(jìn)行類似的比較時(shí)，盡管 MCW 樣品的負(fù)載量高出 75%，但 MCW 的最大強(qiáng)度降低了 ～50%。這表明與 FASP 和 SP3 方法相比，MCW 的蛋白質(zhì)組回收率較低。此外，SP3 處理樣品的復(fù)雜性（根據(jù)色譜圖中存在的不同洗脫峰的數(shù)量估計(jì)）高于其他兩種處理方法中的任何一種。

圖 5.三種治療方法的比較總結(jié)。（A） 已鑒定的 UniProt 登錄號(hào)和獨(dú)特蛋白形式的全局計(jì)數(shù)。（B） 已鑒定的蛋白質(zhì)形式的質(zhì)量分布。（C） 已識(shí)別的 UniProt 登錄號(hào)的維恩圖。（D） 已鑒定的蛋白質(zhì)形式的維恩圖。三種治療方法的結(jié)果根據(jù)圖中的圖例進(jìn)行顏色編碼

我們對(duì)三種治療方法之間主要差異的調(diào)查揭示了 FASP 和 SP3 方法的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。一般來說，SP3 方法在整個(gè) 0–30 kDa 質(zhì)量范圍內(nèi)優(yōu)于 MCW 和 FASP 方法（圖 5B）。唯一值得注意的例外是 3–6 kDa 質(zhì)量 bin，其中 FASP 方案鑒定出的蛋白質(zhì)形式多出 25%。FASP 和 SP3 方法對(duì)低于 9 kDa 的蛋白質(zhì)形式具有顯著優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致在該范圍內(nèi)鑒定的蛋白質(zhì)形式比 MCW 處理的樣品多 >200%。在聚合 0-9 kDa 范圍內(nèi)，F(xiàn)ASP 方案鑒定的蛋白質(zhì)形式略多于 SP3 方案（分別為 803 和 785）。然而，在較高分子量范圍 （>15 kDa） 下，SP3 方法與 MCW 方案相比保持了相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)（鑒定結(jié)果提高了約 80%），而以前在研究人血清蛋白質(zhì)形式時(shí)，MCW 方法的性能與 FASP 方案相當(dāng)。在相同的 15–30 kDa 質(zhì)量范圍內(nèi)，SP3 樣品中鑒定的蛋白質(zhì)形式比 FASP 樣品多 30%（表 S3–S5）。

雖然 PEPPI-SP3 方法在 0-30 kDa 范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了更多的鑒定，但我們想確定三種方法鑒定之間的重疊程度。在查看鑒定出的 UniProt 種質(zhì)數(shù)量時(shí)，SP3 方法鑒定出 MCW 方法鑒定的 93% 和 FASP 方法鑒定的 81%（圖 5C）。然而，當(dāng)我們進(jìn)入蛋白質(zhì)組水平時(shí)，我們觀察到這三種方法之間具有更高程度的唯一性。在 MCW 和 FASP 樣品中鑒定出的與 SP3 相同的蛋白質(zhì)形式的百分比分別降低到 80% 和 62%（圖 5D）。

接下來，我們檢查了質(zhì)譜分析的技術(shù)變異性。我們首先比較了給定處理方法的技術(shù)重復(fù)的色譜圖。在檢查各種 CV 時(shí)，目視檢查沒有顯示技術(shù)重復(fù)之間的實(shí)質(zhì)性差異（圖 S12A 中可以找到 SP3 技術(shù)重復(fù)的 CV – 40 V 示例）。由于色譜圖的差異很小，我們研究了每種處理方法的 MS 運(yùn)行之間蛋白質(zhì)組鑒定的重疊情況（圖 S12B）。在比較每次 MS 運(yùn)行中每種處理方法的所有三個(gè)技術(shù)重復(fù)中鑒定出的蛋白形式數(shù)量時(shí)，我們觀察到 MCW 技術(shù)重復(fù)在其三個(gè)技術(shù)重復(fù)中共享的已鑒定蛋白質(zhì)形式的百分比略高于 FASP 或 SP3 技術(shù)重復(fù)。每次 MS 運(yùn)行都觀察到此趨勢(shì)。我們將技術(shù)變異性至少部分歸因于 DDA 中前體選擇的隨機(jī)性，以及用 FASP 和 SP3 方法處理的樣品復(fù)雜性增加（即，較大的蛋白質(zhì)形態(tài)異質(zhì)性，較低的鑒定重現(xiàn)性）?？梢允褂枚喾N措施來減輕這一限制，其中包括專門增加基于分子量的 PEPPI 餾分的數(shù)量以進(jìn)行分析和/或使用更長(zhǎng)的色譜梯度。使用 SP3 方法處理的單個(gè)樣品的 TIC 痕量具有高度重現(xiàn)性，并且與 MCW 樣品相比，在所有重復(fù)中鑒定的蛋白質(zhì)形式分?jǐn)?shù)僅略有降低，這表明 SP3 方法可能適用于基于無標(biāo)記蛋白質(zhì)形式定量的定量 TDP 研究。

雖然質(zhì)譜水平的技術(shù)差異可以解釋高度唯一性的一些原因，但它不太可能是唯一的原因。下一步調(diào)查是確定各種治療方法中是否存在支持或反對(duì)特定翻譯后修飾的偏倚。由于三種方法之間鑒定的蛋白質(zhì)形式數(shù)量存在很大差異，因此我們將給定 PTM 的頻率標(biāo)準(zhǔn)化為鑒定出的蛋白質(zhì)形式數(shù)量，以產(chǎn)生每 100 個(gè)識(shí)別蛋白質(zhì)形式的比率。然后，我們根據(jù)兩種方法之間比率的 Log2 轉(zhuǎn)換對(duì) 10 個(gè)最常見識(shí)別的 PTM 進(jìn)行了成對(duì)比較（圖 S13）。綜上所述，F(xiàn)ASP 方法比 MCW 方法更能識(shí)別截?cái)喈a(chǎn)物，但不如 SP3 方法。同時(shí)，與 MCW 和 SP3 方法相比，F(xiàn)ASP 方法在識(shí)別蛋白質(zhì) N 端和賴氨酸的乙?；录约敖z氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化事件方面表現(xiàn)出乎意料地差。即使僅考慮 C 評(píng)分為 ≥40 的蛋白質(zhì)形式的 PTM 分析，也可以獲得類似的結(jié)果，這些蛋白質(zhì)形式是表征最好的蛋白質(zhì)。這些觀察結(jié)果表明，雖然 FASP 擅長(zhǎng)識(shí)別小的蛋白質(zhì)形式（即截?cái)喈a(chǎn)物），但它難以保留對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)很重要的 PTM。由于 FASP 和 SP3 方法之間的差異發(fā)生在共享使用 AX-StageTip 之前，因此可以推測(cè) FASP 中使用的離心濃縮器膜正在吸附其中一些蛋白質(zhì)形式。在 PTM 鑒定方面，SP3 方法對(duì)于十種最常見的修飾，尤其是截?cái)喈a(chǎn)物，其性能與 MCW 方法一樣好或更好。通過分析所有三個(gè)數(shù)據(jù)集之間共享并攜帶特定 PTM 的蛋白質(zhì)形式的前體離子強(qiáng)度，證實(shí)了這一點(diǎn)。結(jié)果表明，與 MCW 和 SP3 樣品相比，使用 FASP 清潔的蛋白質(zhì)形式的信號(hào)（特別是攜帶乙?；土姿峄┫鄬?duì)較弱，相反，它們顯示出相當(dāng)?shù)男盘?hào)強(qiáng)度值（圖 S14）。

基于這些結(jié)果，我們?cè)噲D確定其他物理化學(xué)性質(zhì)是否區(qū)分了應(yīng)用三種測(cè)試處理方法后鑒定的蛋白質(zhì)形式。雖然通過 GRAVY 分析計(jì)算的疏水性程度在三個(gè)蛋白群之間沒有顯著差異，但三個(gè)組之間的等電點(diǎn)分布在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同 （p < 0.0001）（圖 S15）。使用 MCW 方法鑒定的蛋白質(zhì)形式的特點(diǎn)是中位數(shù)和平均 pI 分別為 9.7 和 8.9，這與使用 SP3 方法鑒定的蛋白質(zhì)形式的相應(yīng)值（中位數(shù)和平均 pI 分別為 9.1 和 8.4）相差不遠(yuǎn);然而，SP3 方法也導(dǎo)致鑒定出更多的酸性蛋白形式 （第一個(gè)四分位數(shù)的 pI：MCW 和 SP3 分別為 7.0 和 6.4）。相比之下，F(xiàn)ASP 方法的 pI 分布包括較少的基本蛋白質(zhì)形式 （中位數(shù)和平均值分別為 7.0 和 7.3）。如圖 S15B 所示，SP3 方法的 pI 分布介于其他兩種方法之間，這表明這種方法能夠幾乎與 MCW 方法一樣回收堿性蛋白質(zhì)形式，同時(shí)還保留了大部分由 FASP 方法富集的中性和酸性蛋白質(zhì)形式。

最后，使用 DeepTMHMM 進(jìn)行的蛋白質(zhì)跨膜分析表明，SP3 處理有利于恢復(fù)和鑒定預(yù)測(cè)為跨膜的蛋白質(zhì)形式（占該方案獲得的鑒定總數(shù)的 6.5%），優(yōu)于 MCW（占總數(shù)的 5.5%），特別是 FASP（僅占總數(shù)的 2%）方法（圖 6）。

圖 6.使用 DeepTMHMM 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)形態(tài)拓?fù)?。（A） 使用 MCW、FASP 和 SP3 去除去污劑后從樣品中鑒定的蛋白質(zhì)形式的拓?fù)漕愋?。TM：跨膜，SP+TM：信號(hào)肽的跨膜，SP：信號(hào)肽，GLOB：球狀。（B） 在 proteoforms 中鑒定的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域。TM 螺旋 = α 螺旋跨膜，信號(hào)：信號(hào)肽，內(nèi)部：細(xì)胞內(nèi)/胞質(zhì)溶質(zhì)，外：ER/高爾基體/溶酶體的細(xì)胞/腔外，以及 TM Beta：β桶跨膜。一旦對(duì) ID 總數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，F(xiàn)ASP 處理后跨膜蛋白形式就會(huì)減少。

結(jié)論

在第一個(gè) PEPPI 工作流程中，已經(jīng)被廣泛用作 TDP 的樣品預(yù)分餾方法，純化介質(zhì)（通常會(huì)導(dǎo)致低 MW 蛋白損失）或 FASP（耗時(shí)）已被用于純化 PEPPI 組分。在這項(xiàng)研究中，我們開發(fā)了 PEPPI-SP3，這是最新的和第三個(gè) PEPPI 工作流程，它使用 SP3 微珠進(jìn)行了穩(wěn)定而簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)純化。建立回收吸附在 SP3 磁珠上的完整蛋白質(zhì)的工藝對(duì)于實(shí)現(xiàn) PEPPI-SP3 至關(guān)重要，這是通過將室溫下快速回收與 0.05% （w/v） SDS 和使用 AX-StageTip 去除 SDS 相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。AnExSP 將餾分成功純化至與 MCW 相當(dāng)?shù)乃?，并且通過 LC-MS 測(cè)量 TDP 時(shí)未觀察到問題。PEPPI-SP3 在回收低于 20 kDa 的低分子量范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)方面優(yōu)于傳統(tǒng)方法，非常適合 TDP，并且由于 SP3 支持磁珠上加工，PEPPI-SP3 還可以增強(qiáng) BUP 和中下蛋白質(zhì)組學(xué)中的樣品預(yù)處理。 盡管 SP3 在 BUP 中被確立為一種通用的樣品制備方法，但它在 SDS-PAGE 后應(yīng)用于凝膠中的蛋白質(zhì)仍然難以捉摸。本研究中建立的 SDS-PAGE 到 SP3 通路最終允許在基于凝膠的自上而下分析中使用 SP3。

隨著 PEPPI-SP3 在本研究中的成功開發(fā)，現(xiàn)在有三種有效的方法可用于純化 PEPPI 組分（MCW、FASP 和 SP3），但為 TDP 選擇合適的工作流程對(duì)于獲得最佳結(jié)果至關(guān)重要。在作時(shí)間方面，SP3 純化可以在比 FASP 更短的時(shí)間內(nèi)完成，盡管它仍然比 MCW 慢。在可作性方面，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量較少時(shí)，MCW 在使用中具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)橥ǔ：茈y目視確認(rèn)形成的蛋白質(zhì)沉淀，而且 FASP 易于執(zhí)行但耗時(shí)，而 SP3 具有無論樣品量如何都穩(wěn)健和簡(jiǎn)單的理想組合。本研究中通過定量 DIA 分析進(jìn)行的比較評(píng)估也支持 SP3 在定量準(zhǔn)確性方面的優(yōu)越性，使 SP3 成為在 TDP 中純化 PEPPI 組分的首選工作流程，尤其是在與低 MW 蛋白（如組蛋白）的相容性方面。對(duì)于低于 30 kDa 的蛋白質(zhì)形式的 TDP 分析，與 MCW 和 FASP 相比，SP3 方法提供了最多的鑒定數(shù)量，同時(shí)還能夠保留與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的 PTM。

盡管用當(dāng)前的 TDP 很難分析超過 100 kDa 的高 MW 蛋白，但仍然可以應(yīng)用 PEPPI，但對(duì)如此高 MW 的蛋白，MCW 是比 SP3 更好的選擇。MCW 也可能具有成本優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗恍枰?nbsp;SP3 微珠或超濾設(shè)備。PEPPI 的性質(zhì)允許在樣本數(shù)量較多時(shí)使用兩種不同的方法。例如，可以在各自的 MW 范圍內(nèi)同時(shí)使用 SP3 和 MCW 以降低成本。但是，SP3 仍有降低成本的空間。近年來，SP4 方案通過離心而不是磁力架來回收磁珠，已被報(bào)道為 SP3 的改進(jìn)方案，允許用低成本的非磁珠替換磁珠?；诘统杀緟f(xié)議的改進(jìn)將使?jié)撛诘?nbsp;PEPPI-SP4 更加便宜。

TDP 的臨床應(yīng)用在不久的將來可能會(huì)加速，對(duì)大量樣本的高通量處理的需求將相應(yīng)增加。隨著樣品數(shù)量的增加，MCW 和 FASP 的繁瑣作可能是一個(gè)主要障礙。相比之下，市售的自動(dòng)化設(shè)備可用于 SP3，并且在 BUP 的多樣品處理中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。BUP 中 SP3 自動(dòng)加工的關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)可轉(zhuǎn)移到 TDP 的 PEPPI 分餾加工。SP3磁珠請(qǐng)參考 http://www.tools.7z1ocr.cn/Product/1736805216.html

《使用 SP3 純化基于凝膠的樣品分級(jí)用于自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)》總結(jié)

研究背景
1.        蛋白質(zhì)組學(xué)研究目標(biāo)：了解龐大的人類蛋白質(zhì)組，需要開發(fā)全面的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)。
2.       自上而下蛋白質(zhì)組學(xué)（TDP）的需求：自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)難以準(zhǔn)確鑒定蛋白質(zhì)形式，TDP 可直接分析完整蛋白質(zhì)形式，但需樣品預(yù)分餾以檢測(cè)更多蛋白質(zhì)組分。
3.       現(xiàn)有方法的問題：SDS - PAGE 是常用預(yù)分餾方法，結(jié)合 PEPPI - MS 可高效提取凝膠中蛋白質(zhì)，但獲得的餾分含干擾 MS 分析的 CBB 和 SDS，當(dāng)前蛋白質(zhì)純化方法（如 MCW、AnExSP）存在低分子量蛋白損失、操作繁瑣等問題。

實(shí)驗(yàn)方法
1.       材料：使用 MS 相容的人蛋白提取物，經(jīng)還原、烷基化處理，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度。
2.       SDS - PAGE：使用預(yù)制凝膠或自制凝膠，不同染色劑染色。
3.       PEPPI 分級(jí)分離：切取染色凝膠感興趣 MW 區(qū)域，研磨凝膠塊，用含 SDS 的碳酸氫銨溶液提取蛋白質(zhì)，得到 PEPPI 組分。
4.       蛋白質(zhì)純化
MCW：加入甲醇、氯仿和水，離心分層，去除上層，洗滌下層蛋白質(zhì)沉淀。
FASP：通過超濾裝置置換溶劑，用 AX - StageTip 純化。
SP3：將 PEPPI 組分與 SP3 珠子和乙醇混合，吸附蛋白質(zhì)，洗滌珠子，用含 SDS 的碳酸氫銨溶液回收蛋白質(zhì)，再用 AX - StageTip 純化。
5.       檢測(cè)與分析
ContamSpot 檢測(cè)：測(cè)定純化后 PEPPI 組分的殘留 SDS 濃度。
胰蛋白酶 / Lys - C 消化：溶解 PEPPI 組分，用胰蛋白酶 / 賴氨酸 - C 混合物消解。
NanoLC/MS/MS：獲取 MS 和 MS/MS 數(shù)據(jù)，進(jìn)行 DDA 和 DIA 分析。
自上而下的樣品制備與分析：對(duì) HCPE 樣品進(jìn)行 PEPPI 分級(jí)，用不同方法處理，通過色譜和質(zhì)譜進(jìn)一步分離和分析，使用 ProSight PD 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

結(jié)果與討論
1.      通過 SP3 純化 PEPPI 組分
確定磁珠添加量：在 250 至 20 kDa MW 范圍，磁珠添加量對(duì)回收率影響?。坏陀?20 kDa 時(shí)，磁珠量小于 500 μg 回收率略降，因此設(shè)定磁珠量為 500 μg。
選擇蛋白質(zhì)回收試劑：研究多種試劑，發(fā)現(xiàn) 0.05%（w/v）SDS/100 mM ABC 可在 10 分鐘內(nèi)從珠子中回收蛋白質(zhì)，其他試劑效果不佳，最終選擇 SDS 用于蛋白質(zhì)回收。
2.       PEPPI - SP3 工作流程
建立新流程：結(jié)合基于 SP3 的蛋白質(zhì)回收和 AnExSP 純化，建立 PEPPI - SP3 工作流程。該流程中，蛋白質(zhì)組樣品經(jīng) SDS - PAGE 分離、PEPPI 分級(jí)，與 SP3 珠子結(jié)合，洗滌后回收蛋白質(zhì)，再經(jīng) AnExSP 純化進(jìn)行 LC - MS 分析。
流程時(shí)間比較：PEPPI - MCW 時(shí)間為 2.3 小時(shí)，PEPPI - FASP 為 5.3 小時(shí)，PEPPI - SP3 為 3.4 小時(shí)，SP3 改進(jìn)了 FASP 耗時(shí)的問題。
性能驗(yàn)證：SDS - PAGE 結(jié)果顯示，在高 MW 區(qū)域（>100 kDa），使用 AnExSP 的工作流程（FASP 和 SP3）對(duì)蛋白質(zhì)回收率低于 MCW；在低 MW 區(qū)域（<20 kDa），MCW 加工導(dǎo)致低 MW 蛋白回收損失，SP3 處理的餾分譜帶密度高于 FASP。ContamSpot 分析表明 SP3 處理的餾分 SDS 水平低于 0.002%（w/v），與 MCW 相當(dāng)。DIA 分析顯示，三個(gè)工作流程共檢測(cè)到 5379 個(gè)蛋白質(zhì)，SP3 在低 MW 蛋白回收方面表現(xiàn)更好，對(duì)組蛋白的恢復(fù)結(jié)果優(yōu)于其他兩種方法，且在定量準(zhǔn)確度方面優(yōu)于其他工作流程。
3.       PEPPI - SP3 組分的 TDP 分析
鑒定數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)：PEPPI - SP3 方法相對(duì)于 MCW 方法，顯著增加了 60% 的 UniProt 種質(zhì)數(shù)量和 85% 的蛋白質(zhì)組鑒定數(shù)量；與 FASP 方法相比，鑒定數(shù)量多約 20%。
質(zhì)量范圍優(yōu)勢(shì)：SP3 方法在整個(gè) 0 - 30 kDa 質(zhì)量范圍內(nèi)表現(xiàn)出色，在 > 15 kDa 質(zhì)量范圍優(yōu)勢(shì)明顯；FASP 方法在 3 - 6 kDa 質(zhì)量 bin 鑒定出的蛋白質(zhì)形式多出 25%，在 0 - 9 kDa 范圍鑒定的蛋白質(zhì)形式略多于 SP3。
鑒定重疊情況：SP3 方法鑒定出 MCW 方法鑒定的 93% 和 FASP 方法鑒定的 81% 的 UniProt 種質(zhì)；在蛋白質(zhì)組水平，MCW 和 FASP 樣品中鑒定出的與 SP3 相同的蛋白質(zhì)形式的百分比分別為 80% 和 62%。
技術(shù)變異性：SP3 方法處理的單個(gè)樣品 TIC 痕量重現(xiàn)性高，適用于定量 TDP 研究。
翻譯后修飾（PTM）鑒定：FASP 方法在識(shí)別某些 PTM（如蛋白質(zhì) N 端和賴氨酸的乙?；?、絲氨酸等殘基的磷酸化）方面表現(xiàn)較差，SP3 方法在 PTM 鑒定方面性能與 MCW 方法相當(dāng)或更好。
蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)：SP3 方法鑒定的蛋白質(zhì)形式等電點(diǎn)分布介于 MCW 和 FASP 之間，能回收堿性蛋白質(zhì)形式，同時(shí)保留中性和酸性蛋白質(zhì)形式；SP3 處理有利于恢復(fù)和鑒定預(yù)測(cè)為跨膜的蛋白質(zhì)形式。

結(jié)論
1.        開發(fā)新工作流程：開發(fā)了 PEPPI - SP3 工作流程，通過室溫下用 0.05%（w/v）SDS 快速回收吸附在 SP3 磁珠上的完整蛋白質(zhì)，并結(jié)合 AX - StageTip 去除 SDS，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定而簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)純化。
2.       方法優(yōu)勢(shì)：PEPPI - SP3 在回收低分子量（<20 kDa）蛋白質(zhì)方面優(yōu)于傳統(tǒng)方法，適合 TDP，也可增強(qiáng) BUP 和中下蛋白質(zhì)組學(xué)中的樣品預(yù)處理。
3.       工作流程選擇：為 TDP 選擇合適工作流程很關(guān)鍵，SP3 在定量準(zhǔn)確性、操作穩(wěn)健性和對(duì)低 MW 蛋白的相容性方面表現(xiàn)優(yōu)越，是純化 PEPPI 組分的首選工作流程；對(duì)于高 MW 蛋白（>100 kDa），MCW 是更好選擇。
4.       未來展望：隨著 TDP 臨床應(yīng)用需求增加，SP3 可借助市售自動(dòng)化設(shè)備實(shí)現(xiàn)高通量處理，未來可通過改進(jìn)降低成本，如采用 SP4 方案等。