生物交聯(lián)技術——交聯(lián)劑功能及使用特點
普通交聯(lián)劑
普通交聯(lián)劑共十種：EDC、CMC、DCC、DIC、NHS、Slufo-NHS、MAL、NEM、SFB、丁二酸酐。
1. 碳二亞胺鹽酸鹽 EDC
圖1 EDC分子結(jié)構(gòu)
EDC和其他碳二亞胺是零長度交聯(lián)劑。它們使羧酸（-COOH）與伯胺（-NH2）直接偶聯(lián)，而不會成為靶標分子之間最終酰胺鍵交聯(lián)的一部分。因為多肽和蛋白含有多個羧基和氨基，EDC直接介導的交聯(lián)通常會造成多肽的隨機聚合。EDC 首先與羧基發(fā)生反應，形成胺反應性 O-?；愲逯虚g體，該中間體可與氨基快速反應形成酰胺鍵，釋放異脲副產(chǎn)物。中間體在水性溶液中不穩(wěn)定，因此兩步偶聯(lián)程序依賴于 N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 進行穩(wěn)定。在存在 N-羥基磺基琥珀酰亞胺（磺基-NHS）的情況下，EDC 可用于將羧基轉(zhuǎn)換為胺反應性磺基-NHS 酯。這是通過將 EDC 與含有羧基的分子混合并添加磺基-NHS 來實現(xiàn)的。如果不與胺發(fā)生反應，將導致中間體的水解、羧基的再生和 N-取代尿素的釋放。副反應是形成 N-酰脲，通常僅限于位于蛋白疏水性區(qū)域的羧基。該交聯(lián)劑已用于多種應用，如在肽合成中形成酰胺鍵、連接半抗原與載體蛋白形成免疫原、通過 5' 磷酸基標記核酸以及構(gòu)建生物分子的胺反應性 NHS 酯。
2. N-環(huán)己基-N′-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽 CMC
圖 2 CMC分子結(jié)構(gòu)
CMC是除EDC之外另外一種水溶性碳二亞胺試劑。用于羧基和氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵；在親和色譜中用作偶聯(lián)配體；可與巰基反應生成穩(wěn)定的化合物。也用于 RNA 中假尿嘧啶殘基的簡單測序技術。
3. N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺 DCC
圖 3 DCC分子結(jié)構(gòu)
在肽合成中，DCC常被用來活化羧基，是一種很好的低溫生化脫水劑，也用于酸、酐、醛、酮等的合成。不溶于水，在有機相反應居多。DCC可用于促進，7-(叔-丁基二甲基硅基)氧與丙酸的酯化反應生成7-(叔-丁基二甲基硅基)氧庚-2,4-二炔-1-醇。[3]還可用于合成：①通過2-苯乙烯基和2-(4-硝基苯基)異硫氰酸酯[2+2]環(huán)加成合成:1,3-噻唑烷衍生物。②1,3,5-惡二嗪-4-硫酮與苯甲酰異硫氰酸酯[4+2]環(huán)加成反應。③在芳香族(或異芳香族)羧酸存在下，通過與(N-異環(huán)氨基)三苯基磷烷反應，生成空間位阻的1,3,4-惡二唑衍生物。
4. N,N′-二異丙基碳二亞胺 DIC
圖 4 DIC分子結(jié)構(gòu)
DIC是肽合成的偶聯(lián)劑。替代肽合成中的二環(huán)己基碳二亞胺。水不溶性，常溫下液體，比DCC更易分散均勻。
5. N-羥基丁二酰亞胺 NHS
圖 5 NHS分子結(jié)構(gòu)
運用碳二亞胺方法，在改進的酰胺化以及肽偶聯(lián)反應中的添加劑；用于在酰胺鍵形成時活化羰基基團。NHS 的特點：①NHS 的存在使 EDC 介導偶聯(lián)的效率提高；②可使用任何含羧基的分子制備胺反應性 NHS 酯；③典型小分子（例如生物素）的 NHS 衍生物不帶電荷、有機可溶（首先溶于 DMSO）且具有細胞膜可透過性；④高純度結(jié)晶 NHS 可用于生成高質(zhì)量活化衍生物。N-羥基丁二酰亞胺可用于合成氨基酸保護劑、半合成卡那霉素及醫(yī)藥中間體。
6.N-羥基硫代琥珀酰亞胺 鈉鹽 Slufo-NHS
圖 6 Slufo-NHS分子結(jié)構(gòu)
Slufo-NHS是NHS的一種水溶性磺化類似物，用于蛋白的交聯(lián)實驗。Sulfo-NHS的特點：① Sulfo-NHS提高EDC介導的偶聯(lián)效率；② 能夠利用任何含羧基分子形成氨基反應性Sulfo-NHS酯；③ Sulfo-NHS衍生物通常直接溶于水（可直接加入生理緩沖液中），不可穿透細胞膜（可用于標記細胞表面）；④ 高純度的晶體Sulfo-NHS可用于生成高品質(zhì)活化衍生物。Sulfo-NHS能夠控制和修飾碳二亞胺交聯(lián)反應，包括活化羧酸根（—COOH）以偶聯(lián)伯胺基（—NH2）。通過將Sulfo-NHS與一種含羧基分子及一種脫水試劑（如碳二亞胺EDC（EDAC））混合，可以方便地合成相關衍生物。該方法是制備許多類型蛋白標記試劑的基礎，包括氨基反應性熒光染料、生物素親和標簽和聚乙二醇化化合物。
7. 馬來酰亞胺 MAL
圖 7 MAL分子結(jié)構(gòu)
馬來酰亞胺(2，5-吡咯二酮) 是一種新型納米顆粒表面官能團，易于與細胞穿透肽偶聯(lián)；通過點擊化學可實現(xiàn)偶聯(lián)，同時保留其生物功能。馬來酰亞胺用于，銠催化的芳基硼酸共軛芳基化反應。馬來酰亞胺官能化二氧化硅顆?？捎糜诠潭ㄅＱ灏椎鞍祝˙SA）-硼酸（BA）偶聯(lián)物。
8. N -乙基馬來酰亞胺 NEM
圖 8 NEM分子結(jié)構(gòu)
NEM用于共價修飾蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基的試劑，疏基烷化劑，使依賴于NADP的異檸檬酸脫氫酶和許多的內(nèi)切酶失活。水溶液不穩(wěn)定，水解速率為假一級，顯著依賴于pH值。
9. 對甲?；郊姿?N-羥基琥珀酰亞胺酯 SFB
圖 9 SFB分子結(jié)構(gòu)
SFB末端含醛基的氨基反應活性試劑，用于引入醛基，特別是雜交反應中堿性磷酸酶的醛基化。
10. 丁二酸酐（二氫-2,5-呋喃二酮）
圖 10 丁二酸酐分子結(jié)構(gòu)
丁二酸酐易水解、胺化，用于固相氨基表面的共價修飾。丁二酸酐是丁二酸的五元環(huán)環(huán)酸酐。它被廣泛應用于高分子材料、醫(yī)藥、農(nóng)用化學品、染料、表面活性劑、有機阻燃材料的制造。它也可作為離子交換膜的交聯(lián)劑和環(huán)氧樹脂的固化劑?？捎糜谥苽洌孩俟矁r交聯(lián)的氧化藻酸鹽/N-琥珀酰-殼聚糖水凝膠，作為組織工程的注射系統(tǒng)。②制備芯片上的功能化氧化物表面。③作為起始原料，以金屬三氟酸鹽作為催化劑合成聚酯。④作為交聯(lián)劑提高玉米蛋白膜的力學性能和抗菌活性。
同型雙功能交聯(lián)劑
同型雙功能交聯(lián)劑在間隔臂兩端具有相同的反應基團（圖1）。通常，它們只能用于一步法反應過程中，以隨機“固定”或聚合含有相似功能基團的分子。例如，將氨基-氨基交聯(lián)劑添加到細胞裂解液中，將導致蛋白質(zhì)亞基、相互作用蛋白質(zhì)以及在溶液中其賴氨酸側(cè)鏈恰好彼此鄰近的任何其他多肽發(fā)生隨機偶聯(lián)。這是捕獲所有蛋白質(zhì)相互作用的“快照”的理想方法，但不能滿足需要精確交聯(lián)的應用需求。以氨基微球為例，我們可以選擇兩端同時含有醛基、NHS酯等具備氨基反應活性的交聯(lián)劑，交聯(lián)劑的一端可以與微球表面的氨基反應，另外一端則與抗體上的氨基反應(如圖2)。但由于交聯(lián)劑兩端的官能團均可與微球表面的氨基反應，若條件不當，則容易因微球自身交聯(lián)而產(chǎn)生聚集，為了避免該現(xiàn)象的發(fā)生，該反應需要添加大大過量的交聯(lián)劑。
圖1. 戊二醛分子結(jié)構(gòu) 同型雙功能交聯(lián)劑示例
圖 2 戊二醛法偶聯(lián)氨基微球
這里介紹十種同型雙功能交聯(lián)劑，分別為：戊二醛、DSS、DSG、DMA、DMP、DMS、DTBP、DSP、DTSSP、Sulfo--EGS。
1. 戊二醛
戊二醛（見圖1）是一種常用的液體同型雙功能交聯(lián)劑。戊二醛易溶于水（混溶），商品化戊二醛通常為20%~70%水溶液。在已知醛中，戊二醛是一種最好的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，交聯(lián)的特點是活性高，反應快，結(jié)合量高，產(chǎn)物穩(wěn)定，對沸水、酸、酶的抵抗能力強。
2. 辛二酸雙(N-羥基琥珀酰亞胺酯) DSS
圖 3 DSS分子結(jié)構(gòu)
DSS是一種常用的簡單交聯(lián)劑，其在短間隔臂的兩端具有相同的靶向氨基的NHS酯基團。包含8個原子的連接基（8個碳原子長鏈），間隔臂長度（11.4?）是最終的偶聯(lián)分子（即靶標氨基中的氮分子）之間的最大分子距離。DSS是一種膜可滲透的同型雙功能交聯(lián)劑。疏水性，使用前需先溶于有機溶劑。
3. 雙琥珀酰亞胺戊二酸酯 DSG
圖 4 DSG分子結(jié)構(gòu)
DSG是一種氨基反應活性試劑，含5個碳原子長鏈；疏水性，使用前需先溶于有機溶劑。DSG 是一種可降解 (cleavable) 的 ADC 交聯(lián)劑，用于合成可用于合成抗體偶聯(lián)藥物 (ADC)。
4. 二甲基己二酸 DMA
圖 5 DMA分子結(jié)構(gòu)
DMA是一種用于蛋白質(zhì)研究的交聯(lián)劑。氨基反應活性試劑，含6個碳原子長鏈；水溶性，適用于交聯(lián)、蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)修飾。該試劑在中性 PH 下易水解。
5. 二甲基吡咪酯 DMP
圖 6 DMP分子結(jié)構(gòu)
DMP是一種同型雙功能交聯(lián)劑，適用于交聯(lián)、蛋白相互作用和蛋白修飾。試劑在中性pH下易于水解。通常，在pH7.0-10.0的范圍內(nèi)，與伯胺反應形成脒鍵。氨基反應活性試劑，含7個碳原子長鏈；水溶性。
6. 丙二酸二甲酯 DMS
圖 7 DMS分子結(jié)構(gòu)
DMS是氨基反應活性試劑，含8個碳原子長鏈；水溶性，適用于交聯(lián)、蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)修飾。該試劑在中性 pH 下易水解。作為以下反應的反應物：①酪氨酸酶的化學修飾以進行偶聯(lián)，從而產(chǎn)生生物催化酶流動檢測器。②合成膠原-磷酸鈣復合材料的交聯(lián)劑。
7. 3,3′-二硫代雙丙亞氨酸二甲酯 二鹽酸鹽 DTBP
圖 8 DTBP分子結(jié)構(gòu)
DTBP是可硫醇裂解的同雙功能胺反應性交聯(lián)劑。氨基反應活性試劑，含8個碳原子長鏈；水溶性，適用于交聯(lián)、蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)修飾。該試劑在中性PH 下易水解。在偶聯(lián)反應時應避免使用還原劑，其中心二硫鍵可以被還原劑裂解。它包含一個胺反應性亞氨酸酯，亞氨酸酯在 pH 值 8-10 下與伯胺反應形成穩(wěn)定的脒鍵。脒發(fā)生質(zhì)子化，因此，與其修飾的賴氨酸一樣，在生理 pH 值下具有正電荷。
8. 二硫雙(琥珀酰亞胺丙酸酯) DSP
圖 9 DSP分子結(jié)構(gòu)
DSP是水不溶性（首先溶于 DMF 或 DMSO）、同型雙功能 N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS 酯）交聯(lián)劑，具有硫醇可切割性、伯胺反應性，適用于多種應用。DSP 在8個碳原子間隔臂的每端有一個胺反應性 NHS 酯。NHS 酯在 pH 值 7–9 的條件下與伯胺反應可形成穩(wěn)定的酰胺鍵，并釋放 N-羥基琥珀酰亞胺。蛋白（包括抗體）通常在賴氨酸 (K) 殘基的側(cè)鏈和每個多肽的 N 端有若干伯胺，這些伯胺可用作 NHS 酯交聯(lián)試劑的靶標。如果相關的應用需要一個在還原劑條件下不能裂解的穩(wěn)定間隔臂，也可使用 DSP 交聯(lián)劑的不可切割類似物 DSS。
9. 3,3’-二硫雙(磺基琥珀酰亞胺丙酸酯) DTSSP
圖 10 DTSSP分子結(jié)構(gòu)
DTSSP(Sulfo-DSP）是一種廣泛采用的水溶性交聯(lián)劑，其含有胺反應性 N-羥基磺基琥珀酰亞胺（磺基-NHS）酯，位于8碳間隔臂的各端?；腔?NHS 酯在 pH 7-9 條件下與伯胺反應可形成穩(wěn)定的酰胺鍵，同時釋放 N-羥基磺基琥珀酰亞胺離去基團。蛋白（包括抗體）通常在賴氨酸 (K) 殘基的側(cè)鏈中有若干伯胺和每個多肽的 N 端，這些多肽可用作 Sulfo-NHS 酯交聯(lián)試劑的靶標。DTSSP間隔臂中的二硫鍵在pH 8.5條件下易于被10-50mM DTT或TCEP裂解，不可透過膜，允許細胞表面標記。DSS（DTSSP 的非磺化類似物）也可用于需要膜可透過性交聯(lián)劑的應用。
10. 乙二醇雙(磺基琥珀酰亞胺琥珀酸酯) Sulfo--EGS
圖 11 Sulfo-EGS分子結(jié)構(gòu)
Sulfo-EGS 是一種水溶性交聯(lián)劑，含有位于 12 原子間隔臂周圍的胺反應性 sulfo-NHS 酯末端，其可通過在 pH 值 8.5 時使用羥胺處理進行裂解。氨基反應活性試劑，水溶性，空間臂含有兩個酯鍵，可在羥胺作用下裂解生成兩個末端氨基的化合物，釋放乙二醇。膜不滲透性，可進行細胞表面標記；在 pH 值為 8.5 時于 37°C 下使用羥胺處理持續(xù) 3 至 6 小時，形成的交聯(lián)是可逆的。
上一篇文章介紹了什么是同型雙功能交聯(lián)劑，以及其中十種同型雙功能交聯(lián)劑：戊二醛、DSS、DSG、DMA、DMP、DMS、DTBP、DSP、DTSSP、Sulfo--EGS。本篇繼續(xù)簡單介紹一些常用的同型雙功能交聯(lián)劑的特性：BS(PEG)5、BS(PEG)9、碳酰肼、ADH、BMOE、Bis-Mal、DPDPB、Mal-PEG-Mal、CDI、DSC。
1. 雙-五聚乙二醇-琥珀酰亞胺酯BS(PEG)5
2. 碳酰肼
3. 己二酸二酰肼 ADH
4. 雙馬來酰亞胺乙烷 BMOE
5. N,N′-(4,4′-亞甲基二苯基)雙馬來酰亞胺 Bis-Mal
6. N,N'-(丁烷-1,4-二基)雙(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺) DPDPB
7. Mal-PEG-Mal
8. 羰基二咪唑 CDI
9. N-琥珀酰氨基碳酸酯 DSC
圖9 DSC分子結(jié)構(gòu)
對親核試劑有高反應活性，可與帶氨基的分子反應生成尿素類似物，或在無水有機相活化帶羧基的分子，生成氨基反應活性的中間體，用于建立羧基和氨基之間的連接，是合成氨基甲酸酯類化合物的重要試劑。
異型雙功能交聯(lián)劑
異型雙功能交聯(lián)劑的兩端具有不同的反應基團（圖1）。這些試劑不僅可以對具有各自靶標功能基團的分子進行單步法偶聯(lián)，而且可以進行順序（兩步法）偶聯(lián)，最大程度的減少不想要的聚合或自身偶聯(lián)。在順序偶聯(lián)過程中，首先使用交聯(lián)劑最不穩(wěn)定的基團使異型雙功能試劑與一種蛋白質(zhì)反應。除去過量的未反應的交聯(lián)劑后，將經(jīng)修飾的第一種蛋白質(zhì)加入到含有第二種蛋白質(zhì)的溶液中，在該溶液中，通過交聯(lián)劑的第二反應基團發(fā)生反應。最廣泛使用的異型雙功能交聯(lián)劑在其一端具有與氨基反應的琥珀酰亞胺酯（NHS酯），另一端具有與巰基反應的活性基團（例如馬來酰亞胺）。由于NHS酯基團在水溶液中較不穩(wěn)定，所以它通常先與一種蛋白質(zhì)反應。如果第二種蛋白質(zhì)不具有可用的天然巰基，則可在偶連之前添加一步，使用巰基試劑為該蛋白添加巰基。
圖1.異型雙功能交聯(lián)劑示例
Sulfo-SMCC是一種常用的交聯(lián)劑，其在一端具有與氨基反應的Sulfo-NHS酯基團（左），在環(huán)己烷間隔臂的相對端具有與巰基反應的馬來酰亞氨基團（右）。這使其可以用于兩步法順序偶聯(lián)。這里介紹十種異型雙功能交聯(lián)劑，分別為：2-IT（Traut）、SMCC、LC-SMCC、SM(PEG)n 、碘乙酸-NHS酯、EMCS、Mal-（PEG）n-NHS Ester、MBS、SMPB、SMPH。
1. 2-亞氨基硫烷鹽酸鹽 2-IT（Traut）
圖 2 2-IT（Traut）分子結(jié)構(gòu)
Traut試劑，蛋白質(zhì)修飾試劑，通常用于將硫醇基團連接到蛋白質(zhì)和肽上。Traut 試劑是一種用于硫醇化（巰基加成）的環(huán)狀硫代亞氨酸酯化合物。Traut 試劑與伯胺 (—NH2) 反應，可在保持與原始氨基類似的電荷特性的同時引入巰基 (—SH)。一旦添加，就可針對各種有用的標記、交聯(lián)和固定程序中的反應特定靶向巰基。用 2-IT 修飾的毛發(fā)角蛋白纖維的拉曼光譜分析。HCl 顯示出新的二硫化物基團的形成在 pH 7-10 下，通過脒鍵反應，得到游離巰基。可用于制備二硫化物和/或硫醚連接的綴合物。注意：脒鍵具有初始伯胺的正電荷以保持蛋白溶解度。包含五個原子的連接臂，以降低空間位阻。
2. 4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯 SMCC
圖 3 SMCC分子結(jié)構(gòu)
SMCC是一種異雙功能交聯(lián)劑，其包含一個具有胺和巰基反應性的延長間隔基。它通常首先通過酰胺鍵（pH7.5（7.0-9.0）緩沖）與含有伯胺的分子進行偶聯(lián)。第二次偶聯(lián)通過硫醚鍵（pH6.8（6.5-7.0）緩沖）與含有游離巰基的分子進行特異性偶聯(lián)。SMCC包含九個原子連接子。與芳族間隔基相比，延伸的脂族間隔基可在偶聯(lián)之前穩(wěn)定馬來酰亞胺。在水溶液中，NHS 酯水解降解是競爭反應，其速率隨 pH 值的增加而提高。馬來酰亞胺基團比 NHS-酯基團更穩(wěn)定，但水解緩慢，且在 pH 值 > 7.5 時會失去對巰基的反應特異性。由于這些原因，通常在 pH 7.2–7.5 條件下使用這些交聯(lián)劑進行偶聯(lián)，與 NHS 酯（胺靶向）反應的時間在與馬來酰亞胺（巰基靶向）反應之前或二者同時進行?？捎糜谥苽涿该庖呓Y(jié)合物和半抗原載體分子結(jié)合物。水不溶性（可首先溶于 DMF 或 DMSO 中，或者選擇水溶性的Sulfo-SMCC ）。
3. 琥珀酰亞胺 4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧基-(6-氨基己酸) LC-SMCC
圖 4 LC-SMCC分子結(jié)構(gòu)
LC-SMCC是SMCC 的長鏈形式，是一種胺對巰基交聯(lián)劑，含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應性基團，位于長環(huán)己烷穩(wěn)定間隔臂（16.2 埃，SMCC 8.3埃）的相對兩端。LC-SMCC與SMCC應用較為一致。
4. PEG化，長鏈SMCC交聯(lián)劑 SM(PEG)n
圖 5 SM(PEG)n 分子結(jié)構(gòu)
SM(PEG)n NHS-和馬來酰亞胺活化的PEG化合物用于蛋白質(zhì)和其他分子中的伯胺（NH 2）和巰基（SH）之間的交聯(lián)。產(chǎn)品提供了一整套化合物，每種化合物具有相同的異雙功能結(jié)構(gòu)（NHS-PEGn-馬來酰亞胺），但離散的乙二醇單元（n = 2,4,6,8,12或24）的數(shù)量不同。N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS）基團在pH 7-9下與賴氨酸和N-末端氨基能夠發(fā)生有效的特異性反應，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。馬來酰亞胺基團在pH 6.5-7.5下與還原型巰基反應，形成穩(wěn)定的硫醚鍵。通過柔性PEG間隔臂不可逆地交聯(lián)蛋白質(zhì)或肽；聚乙二醇間隔臂有助于保持偶聯(lián)物溶解度；具有確定結(jié)構(gòu)和分子量的純化合物，確?？芍貜偷牡鞍踪|(zhì)修飾效果；PEG間隔臂提供獨特的優(yōu)勢，包括增加穩(wěn)定性、降低聚集傾向和降低免疫原性。
5. 碘乙酸-NHS酯
圖 6 碘乙酸-NHS酯分子結(jié)構(gòu)
碘乙酸-NHS酯具有氨基和巰基反應性的雙異官能團交聯(lián)劑。典型情況下，最初通過 pH 7.5 (6.5-8.5) 緩沖條件下的酰胺鍵偶聯(lián)到含有伯胺的分子上，接著通過 pH 7.5 (7.0-8.0) 緩沖條件下的硫醚鏈與含有自由巰基的分子進行特異性次級鍵合。用于制備酶免疫交聯(lián)劑和半抗原載體分子偶聯(lián)物。提供兩個原子的連接基。碘乙?；哂泄饷粜?，使用時注意避光。
6. 6-(馬來酰亞胺基)己酸琥珀酰亞胺酯 EMCS
圖 7 EMCS分子結(jié)構(gòu)
EMCS 是一種具有氨基和巰基反應性的雙異官能團交聯(lián)劑。含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應性基團，位于中等長度間隔臂（9.4 埃）的相對兩端。NHS 酯末端在 pH 值 7-9 條件下與伯胺偶聯(lián)，形成穩(wěn)定酰胺鍵；馬來酰亞胺在 pH 值 6.5-7.5 條件下與 -SH 基團反應，形成穩(wěn)定硫醚鍵；不溶于水（首先溶于 DMF 或 DMSO中，或者 選擇水溶性的Sulfo-EMCS ）。EMCS 是一種制備半抗原結(jié)合物和酶免疫偶聯(lián)物的獨特而有用的試劑。含有馬來酰亞胺側(cè)鏈作為抗腫瘤劑的阿霉素葡糖苷酸前藥的合成。
7. 馬來酰亞胺-(PEG)n-琥珀酰亞胺酯 Mal-(PEG)n-NHS Ester
圖 8 Mal-(PEG)n-NHS Ester分子結(jié)構(gòu)
Mal-PEGn-NHS Ester（n=2，6，8，12）是一種具有短環(huán)氧乙烷間隔基的異雙功能交聯(lián)劑，用于將胺基與含巰基化合物或生物分子的連接。馬來酰亞胺官能團將與巰基反應，而琥珀酰亞胺酯基團將與胺反應。間隔基長度根據(jù)PEG數(shù)量不一樣在 17.6埃~53.3埃間。
8. 3-馬來酰亞胺基苯甲酸 N -羥基琥珀酰亞胺酯 MBS
圖 9 MBS分子結(jié)構(gòu)
MBS 是一種對伯胺和巰基具有反應性的雙異官能化交聯(lián)劑。通常，初始反應在pH為7.0時，通過酰胺鍵偶聯(lián)至含伯胺的分子，然后在相同pH通過硫醚偶聯(lián)至含巰基的化合物。用于制備酶免疫交聯(lián)劑和半抗原載體分子偶聯(lián)物。MBS可用作固定劑，用于保持花粉管纖維狀肌動蛋白的分布。它用于花粉管時產(chǎn)生的損傷較少。水不溶性（可首先溶于 DMF 或 DMSO 中，或者選擇水溶性的Sulfo-MBS）說明：芳基馬來酰亞胺比烷基馬來酰亞胺連接基更不穩(wěn)定。
9. 琥珀酰亞胺基 4-(p-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯 SMPB
圖 10 SMPB分子結(jié)構(gòu)
SMPB 是一種胺對巰基交聯(lián)劑，含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應性基團（位于中等長度芳香族間隔臂（11.6 埃）的另一端）;MBS 的擴展鏈類似物;；不可裂解；不溶于水（首先溶于 DMF 或 DMSO，或者選擇水溶性的Sulfo-SMPB）；與 SMPB 形成的偶聯(lián)物在血清中比 SPDP 偶聯(lián)物更穩(wěn)定。
10. 琥珀酰亞胺 6-((β-馬來酰亞胺丙酰氨基)己酸) SMPH
圖 11 SMPH分子結(jié)構(gòu)
SMPH 是一種胺對巰基交聯(lián)劑，含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應性基團，位于長間隔臂（14.2 埃）的相對兩端。與 SMPB 相比，碳鏈較長且溶解度較高；NHS 酯在 pH 值 7-9 條件下與伯胺反應，形成穩(wěn)定的酰胺鍵；馬來酰亞胺在 pH 值 6.5-7.5 條件下與 -SH 基團反應，形成穩(wěn)定的硫醚鍵；不可裂解；不溶于水（首先溶于 DMF 或 DMSO）。
上一篇文章介紹了什么是異型雙功能交聯(lián)劑，以及其中十種異型雙功能交聯(lián)劑：2-IT（Traut）、SMCC、LC-SMCC、SM(PEG)n 、碘乙酸-NHS酯、EMCS、Mal-（PEG）n-NHS Ester、MBS、SMPB、SMPH。本篇繼續(xù)簡單介紹一些常用的異型雙功能交聯(lián)劑的特性：SPDP、LC-SPDP、GMBS、BMPS、Sulfo-KMUS、SMPT、SIAB、SATA、SAMSA。
1. 3-（2-吡啶二硫）丙酸 N -羥基琥珀酰亞胺酯 SPDP
圖 1 SPDP分子結(jié)構(gòu)
SPDP是具有胺和巰基反應性的異型雙功能交聯(lián)劑。通常先在pH 7.5(6.5-8.5)的緩沖條件下通過酰胺鍵與含有伯胺的分子偶聯(lián)。在pH 8.0(7.5-8.5)的緩沖條件下通過硫醇-二硫化物交換反應，與含有游離巰基的分子特異性二次偶聯(lián)。此外，該試劑還可在初次偶聯(lián)和還原接頭后用作受保護的硫醇化試劑。通常用于氨基微球的硫醇化。SPDP不溶于水（首先溶于 DMF 或 DMSO）；SPDP中間臂鏈接PEG相比普通-CH2-具有更佳的水溶性；同時連接NHS-酯能更好的避免蛋白聚集。應用：蛋白的可逆交聯(lián)；通過連接至賴氨酸殘基向蛋白添加巰基；通過兩步反應蛋白交聯(lián)形成抗體-酶和其他生物偶聯(lián)物；半抗原連接至載體蛋白用于抗體生產(chǎn)；制備免疫毒素偶聯(lián)物。
2. 琥珀酰亞胺 -6(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)已酸酯 LC-SPDP
圖 2 LC-SPDP 分子結(jié)構(gòu)
LC-SPDP 是一種長鏈異型雙功能交聯(lián)劑，可以通過 NHS 酯和吡啶基二硫基反應性基團與半胱氨酸巰基形成可切割（可還原）二硫鍵，實現(xiàn)胺與巰基的偶聯(lián)。間隔臂中的二硫鍵在pH 8.5條件下易于被10-50mM DTT或TCEP裂解。SPDP 類試劑的胺反應部分是 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯。反應最通常在 pH 7-8 的磷酸鹽、碳酸鹽/碳酸氫鹽或硼酸鹽緩沖液中進行?？梢允褂闷渌话罚ɑ蛄虼蓟蚨蚧镞€原劑–參見巰基反應性的討論）的緩沖劑。pH 值越高，反應和水解降解的速率越大；例如，NHS 酯的半衰期在 pH 值為 7 時為數(shù)小時，而在 pH 值為 9 時不到 10 分鐘。SPDP 和 LC-SPDP 等 NHS 酯試劑的水溶性有限，在將其添加到反應混合物之前，必須先將其溶于有機溶劑中。諸如 Sulfo-LC-SPDP 的 Sulfo-NHS-酯試劑是水溶性的，可以直接添加到水性反應混合物中。
3. 4-馬來酰亞胺基丁酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯 GMBS
圖 3 GMBS分子結(jié)構(gòu)
GMBS一種具有胺和巰基反應性的異雙功能交聯(lián)劑。通常，最初通過在 pH 7.5 (6.5-8.5) 下緩沖的酰胺鍵與含有伯胺的分子偶聯(lián)。通過硫醚鍵在 pH 6.8 (6.5-7.0) 下緩沖的含游離巰基的分子的特異性二次偶聯(lián)。用于制備酶免疫結(jié)合物和半抗原載體分子結(jié)合物。不溶于水（首先溶于 DMF 或 DMSO，或者選擇水溶性的Sulfo-GMBS）。脂肪族間隔系列的 C4 同系物包括 AMAS、BMPS、GMBS 和 EMCS。
4. 3-（馬來酰亞胺基）丙酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯 BMPS
圖 4 BMPS分子結(jié)構(gòu)
BMPS 是一種胺對巰基交聯(lián)劑，含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應性基團，位于短間隔臂 (5.9 ?) 的相對兩端。用于諸如酶免疫測定前半抗原與酶交聯(lián)或熒光底物與肽抗原交聯(lián)等技術，用于熒光免疫測定。
5. N-κ馬來酰亞胺基十一烷氧基-磺基琥珀酰亞胺酯 Sulfo-KMUS
圖 5 Sulfo-KMUS分子結(jié)構(gòu)
Sulfo-KMUS 是一種水溶性胺對巰基交聯(lián)劑，含有 NHS 酯和馬來酰亞胺反應性基團，位于長間隔臂 (16.3 ?) 的相對兩端。NHS酯在pH 7-9時與伯胺反應生成酰胺鍵，馬來酰亞胺在pH6.5-7.5值下與巰基反應，形成穩(wěn)定的硫醚鍵。在水溶液中，NHS酯的水解降解是一個競爭反應，其速率隨pH值的增加而增加。馬來酰亞胺組比NHS-酷組更穩(wěn)定，但在pH值大于7.5時，會緩慢水解并失去其對巰基的反應特異性。由于這些原因，涉及這種類型的異雙官能交聯(lián)劑的共扼實驗通常在pH7.2-7.5下進行，與NHS-酯(胺靶向)反應之前或與馬來酰亞胺(巰基靶向) 反應同時完成。
6. 4-琥珀酰亞胺氧羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫基)甲苯 SMPT
圖 6 SMPT分子結(jié)構(gòu)
SMPT 是一種長鏈交聯(lián)劑，可以通過 NHS 酯和吡啶基二硫基反應性基團與半胱氨酸巰基形成強（位阻）但可切割（可還原）二硫鍵，實現(xiàn)胺與巰基的偶聯(lián)。SMPT常用于將毒素分子與針對細胞表面抗原的單克隆抗體偶聯(lián)。SMPT產(chǎn)生的這些免疫毒素具有很強的殺傷力，因為與沒有可切割鍵的結(jié)合物(如SPDP)相比，可切割的二硫鍵具有更大的細胞毒性。此外，在間隔臂中的吡啶-2-硫酮旁邊是苯環(huán)和與阻礙二硫鍵的碳相鄰的甲基，允許在體內(nèi)特殊的共扼穩(wěn)定性。SMPT具有比其他NHS交聯(lián)劑在水溶液中更穩(wěn)定的水解的額外好處。
7. 琥珀酰亞胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯 SIAB
圖 7 SIAB分子結(jié)構(gòu)
SIAB 是一種中等長度 (10.6 ?) 的交聯(lián)劑，可以通過 N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 酯和碘乙酰反應性基團實現(xiàn)胺與巰基的偶聯(lián)。Sulfo-SIAB是以鈉鹽的形式存在的，水溶性約為10mM。SIAB必須首先溶解在有機溶劑中，如DMSO或DMF，然后添加到反應混合物中。SIAB是親脂性的，膜滲透性的，不具有帶電基團。
8. N-琥珀酰亞胺 S-乙酰巰基乙酸酯 SATA）
圖 8 SATA分子結(jié)構(gòu)
SATA 是一種短鏈（2.8 ?）試劑，用于伯胺的共價修飾以及添加受保護但可暴露的巰基，能夠?qū)崿F(xiàn)異型雙功能交聯(lián)。在溫和條件下可使硫醇去保護。通常在pH為7.5時引發(fā)耦合反應，通過酰胺鍵生成含伯胺的分子。在中性pH時可與0.05M羥胺發(fā)生去保護反應。用于制備酶免疫交聯(lián)劑和半抗原載體分子偶聯(lián)物。SATA中間臂鏈接PEG相比普通-CH2-具有更佳的水溶性；更好的避免蛋白聚集。
9. S-乙酰巰基丁二酸酐 SAMSA
圖 9 SAMSA分子結(jié)構(gòu)
S-乙酰巰基丁二酸酐是一種胺反應性試劑，含有巰基。當被胺親核試劑攻擊時，酸酐區(qū)域打開，形成胺鍵。但是，在該開環(huán)反應過程中，形成了游離的羧酸根基團，使分子帶負電。電荷逆轉(zhuǎn)影響蛋白質(zhì)的活性和分子的構(gòu)象。
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