常用蛋白酶酶切位點(diǎn)及融合標(biāo)簽去除策略
目前主要通過(guò)4種方法移除多肽標(biāo)簽，即化學(xué)法、內(nèi)切蛋白酶法、外切蛋白酶法以及基于內(nèi)含肽的自我剪切法。
最常用的便是溴化氰（CNBr）法，原理是CNBr能斷裂甲硫氨酸和下游氨基酸殘基之間的肽鍵（Met-X， X為任意氨基酸）?；瘜W(xué)法具有效率高、耗時(shí)短、成本低等優(yōu)點(diǎn)?；瘜W(xué)法也有很多不足，例如化學(xué)法所需的反應(yīng)條件容易破壞目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，而且所使用的溴化氰等試劑具有毒性，不適合藥用蛋白的處理及研究?；瘜W(xué)法使用的溴化氰能夠使蛋白質(zhì)在甲氨酸殘基處斷裂，如果目標(biāo)蛋白含有內(nèi)源甲氨酸殘基，會(huì)發(fā)生非特異性斷裂，導(dǎo)致降解和破壞目標(biāo)蛋白。而且化學(xué)法切割時(shí)容易產(chǎn)生副反應(yīng)，會(huì)對(duì)修飾一些氨基酸側(cè)鏈而改變目標(biāo)蛋白的特性。這些缺點(diǎn)限制了化學(xué)法在移除多肽融合標(biāo)簽時(shí)更為廣泛的應(yīng)用。
常用的內(nèi)切蛋白酶及識(shí)別的位點(diǎn)如下：
| 蛋白酶 | 識(shí)別位點(diǎn) | 其他特征 |
|
Thrombin |
Leu-Val-Pro-Arg↓Gly-Ser （LVPRG↓S） |
切割效率與二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān) |
|
Factor Xa |
Ile-Glu/Asp-Gly-Arg↓ （IE/DG↓R） |
切割效率與GR附近的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān) |
|
Enterokinase |
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓（DDDDK↓） |
切割效率與二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān) |
|
TEV protease |
Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly（ENLYFQ↓G） |
|
|
PreScission |
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro（LEVLFQ↓GP） |
|
|
HRV 3C Protease |
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro（LEVLFQ↓GP） |
|
|
SUMO Protease |
識(shí)別SUMO的三維結(jié)構(gòu) |
|
內(nèi)切蛋白酶的特異性和酶切效率主要受3種因素影響。第一種因素是內(nèi)切蛋白酶固有的非特異性酶切。有些內(nèi)切蛋白酶如FactorXa和凝血酶存在著第二切割位點(diǎn)，而且隨著反應(yīng)條件的不同其第二位點(diǎn)的切割效率也是變化的。非特異性切割可以通過(guò)控制反應(yīng)條件減少，但不能完全消除，因此需要優(yōu)化條件減少非特異位點(diǎn)切割，并且需要檢測(cè)切割后的產(chǎn)物，以確定目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的均一性。第二種因素是目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)。由于蛋白質(zhì)肽鏈的空間折疊，有些融合蛋白的酶切識(shí)別位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，內(nèi)切蛋白酶活性中心難以接觸到識(shí)別位點(diǎn)，導(dǎo)致酶切效率低下。例如利用腸激酶對(duì)處于聚集狀態(tài)的目標(biāo)蛋白所含的多聚組氨酸標(biāo)簽的切除研究證實(shí)，只有使目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，暴露出腸激酶的切割識(shí)別位點(diǎn)，才能很好地達(dá)到標(biāo)簽切除的目的。第三種因素是溶液中化學(xué)成分如去垢劑的影響。在純化一些疏水性蛋白和跨膜蛋白時(shí)，需要加入去垢劑，有可能會(huì)影響內(nèi)切蛋白酶活性而降低酶切效率。例如去垢劑在低濃度范圍內(nèi)對(duì)TEVprotease酶切效率影響不明顯，但是達(dá)到一定濃度后會(huì)明顯抑制酶活性
。
三、外切蛋白酶法外切蛋白酶的種類(lèi)包括氨基肽酶和羧肽酶，分別可以用來(lái)切除位于目標(biāo)蛋白N端和C端的融合標(biāo)簽，例如氨基肽酶M(aminopeptidaseM，APM)和羧肽酶A和B(carboxypeptidaseA和B，CPA和CPB)等。
在利用外切蛋白酶法移除融合標(biāo)簽的系統(tǒng)中，最有代表性的是QIAGEN公司基于二肽氨基肽酶I(dipeptidylaminopeptidase I，DPPI，商業(yè)名稱(chēng)為DAPase)的作用機(jī)理所提供的TAGZyme系統(tǒng)，用于移除N端的多聚組氨酸標(biāo)簽。DAPase能夠從蛋白質(zhì)N端依次切除二肽，切除反應(yīng)的終止位點(diǎn)為N端出現(xiàn)Lys、Arg、Gln殘基，或者在N端第2個(gè)或第3個(gè)氨基酸殘基是Pro。如果目標(biāo)蛋白在N端具有天然的DAPase切除終止位點(diǎn)，可以直接設(shè)計(jì)利于DAPase切除的融合標(biāo)簽，構(gòu)建相應(yīng)重組蛋白質(zhì)。
內(nèi)含肽(intein)是前體蛋白中的一段插入序列，能夠自我催化蛋白質(zhì)的剪接(protein splicing)，使自身從前體蛋白中切除，并將兩側(cè)外顯肽(extein)連接形成成熟蛋白。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)450個(gè)以上的內(nèi)含肽，分布于真核生物、真細(xì)菌和古細(xì)菌、病毒和噬菌體。
相比于化學(xué)法，自我剪切法條件溫和，不會(huì)使目標(biāo)蛋白損傷變性。相比于酶切法，自我剪切法簡(jiǎn)化了純化過(guò)程，節(jié)約了成本和時(shí)間。傳統(tǒng)的酶切法需要多次過(guò)柱和多步純化，以分離融合蛋白和除去蛋白酶及融合標(biāo)簽。而自我剪切法能夠免除酶的消耗及過(guò)柱所產(chǎn)生的昂貴費(fèi)用。
自我剪切法也存在一些缺點(diǎn)，例如外顯肽靠近內(nèi)含肽的殘基能夠影響自我剪切效率。對(duì)于某些蛋白質(zhì)，需要在目標(biāo)蛋白與內(nèi)含肽的接頭端引入氨基酸殘基提高剪切效率，從而會(huì)給目標(biāo)蛋白產(chǎn)物帶來(lái)多余的氨基酸殘基。
自我剪切法的誘導(dǎo)條件也不易控制，融合蛋白可能會(huì)在表達(dá)過(guò)程中發(fā)生體內(nèi)誘導(dǎo)的提前剪切導(dǎo)致純化失敗，而且有些自我剪切的誘導(dǎo)劑如巰基試劑會(huì)影響目標(biāo)蛋白的二硫鍵及相應(yīng)結(jié)構(gòu)。
- 上一篇：一文讀懂細(xì)胞磁分選（MACS） 2018/5/9
- 下一篇：Protein A磁珠, Protein G磁珠, Prot 2018/4/22