DNA提取經(jīng)典方法之——?jiǎng)游锝M織DNA提取
一、材料
哺乳動(dòng)物新鮮組織。
二、設(shè)備
移液管、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋。
三、試劑
1、分離緩沖液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4，10mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA。
2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，乙醚，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無(wú)水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
四、操作步驟
1.切取組織5g左右，剔除結(jié)締組織，吸水紙吸干血液，剪碎放入研缽(越細(xì)越好)。
2.倒入液氮，磨成粉末，加10ml分離緩沖液。
3.加1ml 10% SDS，混勻，此時(shí)樣品變得很粘稠。
4.加50μl或1mg 蛋白酶 K，37℃保溫1-2小時(shí)，直到組織完全解體。
5.加1ml 5mol/L NaCl，混勻，5000rpm離心數(shù)秒鐘。
6.取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后，3000rpm離心 5分鐘。
7.取上層水相至干凈離心管，加2倍體積乙醚抽提(在通風(fēng)情況下操作)。
8.移去上層乙醚，保留下層水相。
9.加1/10 體積3mol/L NaAc，及2倍體積無(wú)水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。
10.用玻棒鉤出DNA沉淀，70%乙醇中漂洗后，在吸水紙上吸干，溶解于1ml TE中，-20℃保存。
11.如果DNA溶液中有不溶解顆粒，可在5000rpm短暫離心，取上清; 如要除去其中的RNA，可加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃保溫30分鐘，用酚抽提后，按步驟9-10重沉淀DNA。
五、Purimag磁珠用于提取DNA
使用Purimag的核酸提取磁珠，可以高效提取植物組織DNA。通常在經(jīng)典方法沉淀DNA步驟之前加入磁珠，即可讓DNA吸附在PuriMag磁珠表面，洗脫后即可得到高純度的DNA。
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